정상안압녹내장의 발병관련유전자와 단일염기다형성에 관한 연구

Abstract

복합유전자 질환은 여러 유전자의 단일염기다형성 (SNP: single nucleotide polymorphism)에 의해 발생하며, 특히 호발 질환에서 발병관련 유전자와 그 SNP의 규명은 미래 분자진단의 가장 큰 도구이다. 녹내장은 그 유병률이 40세 이상에서 약 2%에 달하는 호발 질환이며, 최대 실명 원인 중 하나이다. 특히 서구인에서는 안압이 상승하는 녹내장이 대부분인 반면, 한국인, 일본인 등에서는 정상안압녹내장이 60% 이상을 차지한다. 정상안압녹내장에서 신경보호 기능의 이상 및 혈관 수축이 보고되고 있으나 근본적인 발생 원인 및 위험 인자 등에 대한 연구는 초기단계에 있다. 녹내장은 가족력이 있을 수 있고, 특히 정상안압녹내장은 특정 민족 및 지역에서 높은 유병률을 보이는 점으로 보아, 유전적 요인, 특히 여러 유전자의 SNP가 발병에 관련될 것으로 추정된다. 본 연구의 목적은 정상안압녹내장에서 일차 후보 유전자군인 신경보호 및 혈관의 수축·이완 관련 유전자들에서 발병관련 유전자와 그 SNP을 규명하는데 있다. 대상 환자는 정상안압녹내장 (안압≤ 21 mmHg) 환자 37명 (남:여= 13:24, 연령= 45.7 11.1)이었고, 대조군은 성별-연령이 유사한 정상인 42명 (남:여=15:27, 연령= 48.8 9.0)이었다. 전신질환이나 심혈관계 질환이 있는 경우는 대상에서 제외하였다. 대상 유전자는 모두 7종으로, 신경보호 기능 관련 유전자 2종 (BDNF, APOE), 혈관의 수축·이완 관련 유전자 4종 (Survivin, ACE, MTHFR, NOS3) 및 정상안압녹내장의 유전 표지자로서의 가능성이 보고된 OPA1 유전자이었다. 이 중 BDNF와 Survivin은 sequencing법으로 SNP 발굴 후, 대상환자의 20% 이상에서 발견된 SNP에 대해서 SNP scoring을 시행하였다. 다른 5개 유전자는 기존에 보고된 SNP에 대해서 PCR/RFLP 또는 pyrosequencing법으로 SNP scoring을 시행하였다. 최종적으로 통계적 방법으로 정상안압녹내장과의 관련성을 chi-square, Fisher's exact test로 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. BDNF와 Survivin 유전자의 SNP 발굴 결과, 각각 8종 (460C>A, 601A>T, c.251C>T, c.139A>C, IVS5-71T>A, c.422A>T, c.479T>C, c.758G>A)과 9종의 SNP (3205C>A, 5129C>G, 5203C>G, 5250A>G, 5312C>G, 12000A>G, 12192C>T, 12614T>C, 12874A>G)이 발굴되었다. 이 중 6종의 BDNF SNP (460C>A, 601A>T, c.139A>C, IVS5 -71T>A, c.422A>T, c.479T>C)과 7종의 Survivin SNP (3205C>A, 5129C>G, 5203C>G, 5250A>G, 5312C>G, 12000A>G, 12874A>G)은 보고되지 않은 새로운 SNP이었다. 2. MTHFR 677C>T와 NOS3 894G>T가 정상안압녹내장과 유의한 관련성을 보였으며 (P= 0.030, P= 0.019), OPA1 IVS8+4C>T와 ACE I/D는 통계적 유의성은 없었으나, 정상안압녹내장에서 높은 경향을 보였다 (P= 0.097, P= 0.098). 3. MTHFR 677C>T의 TT 동형접합체는 정상안압녹내장의 위험도를 3배 증가시켰고 [odds ratio (CC+CT vs. TT)= 3.25, 95% CI= 1.09-9.73)], NOS3 894G>T의 GT 이형접합체와 T 대립유전자는 정상안압녹내장의 위험도를 5배 감소시켰다 (GG vs. GT: odds ratio= 0.18, 95% CI= 0.04-0.90; G vs. T: odds ratio= 0.21, 95% CI= 0.04-0.97). 4. SNP scoring이 실시된 BDNF 유전자의 SNP 4종 (601A>T, c.251C>T, IVS5-71T>A, c.758G>A)과 Survivin 유전자의 SNP 3종 (12000A>G, 12192C>T, 12614T>C) 모두는 정상안압녹내장과 유의한 관련성을 보이지 않았다. 결론적으로, 혈관수축 이완에 관여하는 MTHFR 677C>T와 NOS3 894G>T가 정상안압녹내장의 발병관련유전자와 SNP로 규명되었다. 전자는 정상안압녹내장의 위험인자로, 후자는 방어인자로 생각된다. BDNF와 Survivin 유전자는 정상안압녹내장의 일차적인 위험인자에서 제외되었다. 그러나 복합유전자 질환은 세분화된 임상 양상과 각 유전자와의 연관성이 밝혀지고 있으므로, 앞으로 정상안압녹내장의 층화된 임상 양상의 분류에 따른 분석이 필요할 것으로 생각된다. 이상의 연구로 혈관 수축 기능이 정상안압녹내장의 발병의 원인임을 분자유전학적으로 입증할 수 있었고, 강력한 신경보호 물질인 BDNF의 유전자는 일차적으로 정상안압녹내장과는 관련성이 없는 것으로 밝혀졌다. 그러나 정상안압녹내장의 시신경 변성에 대한 여러 신경친화 인자들과의 관련성이 중요하게 보고되고 있으므로, BDNF이외에 다른 신경보호 기능 유전자들에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.;Complex diseases arise from the interaction of multiple segregating single nucleotide polymorphisms (SNPs) and environmental contributions. In the complex diseases, identification and determination of genes and their SNPs being responsible for beginning and proceeding of the diseases will be powerful tools of molecular diagnosis in the future. Glaucoma is the second commonest cause of blindness worldwide, affecting about 2% of the population aged more than forty years. It is characterized by progressive loss of optic nerve axons and visual field damage. The majority of glaucoma in Caucasian is the primary open angle glaucoma type, where elevated intraocular pressure is a major feature. Normal tension glaucoma (NTG) is another form of glaucoma, associated with intraocular pressure that is within the statistically normal range of the population, and accounts for approximately 60% of the glaucoma in Koreans or the Japanese. At present, little is known concerning the genetic determinants and risk factors of NTG. In vivo and in vitro studies suggest that the neurodegeneration and vascular dysfunction may be responsible for the death of retinal ganglion cells and lead to the NTG. Therefore, neuroprotection factor against the neurodegeneration and vascular tone regulator may represent appropriate candidate gene conferring risk to the NTG. The aim of our study was to identify genetic determinant endowing the susceptibility and to determine risk factors of the NTG. Thirty-seven well characterized NTG patients (male: female= 13:24, age= 45.7 11.1 years) and sex-age matched 42 control subjects (male: female =15:27, age= 48.8 9.0 years) were studied. Twenty-four patients were screened for sequence variations in the BDNF (brain-derived neurotrophic factor) and Survivin (apoptosis inhibitor of vessel wall) gene by direct sequencing. Amongst altered sequences in NTG subjects, SNPs found in more than 20% of patients were examined in other NTG patients and normal controls by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism or pyrosequencing. Separately, these 37 patients and 42 controls were scored for five known SNPs: ACE (angiotensin I converting enzyme) I/D, MTHFR (5,10-methylenetetrahydrofolate reductase) 677C>T, and NOS3 (nitric oxide synthase 3) 894G>T contributing alternation of vascular distensibility, APOE (apolipoprotein E) E2/E3/E4 for neuroprotection, and OPA1 (optic atrophy 1) IVS8+4C>T, a possible marker for the NTG. Difference in the genotype and allele frequencies of these SNPs between the NTG patients and controls were analyzed by chi-square or Fisher's exact test. 1. A total of eight SNPs in BDNF (460C>A, 601A>T, c.251C>T, c.139A>C, IVS5-71T>A, c.422A>T, c.479T>C, c.758G>A) and nine in Survivin (3205C>A, 5129C>G, 5203C>G, 5250A>G, 5312C>G, 12000A>G, 12192C>T, 12614T>C, 12874A>G) were found. Among them, six of BDNF (460C>A, 601A>T, c.139A>C, IVS5-71T>A, c.422A/T, c.479T>C) and seven of Survivin (3205C>A, 5129C>G, 5203C>G, 5250A>G, 5312C>G, 12000A>G, 12874A>G) were novel. 2. Of the scored 12 SNPs including four of BDNF and three of Survivin, MTHFR 677C>T (P=0.030) and NOS3 894G>T (P=0.019) were strongly associated with the occurrence of NTG. ACE I/D and OPA1 IVS8+4C>T tended to be high in the NTG (P=0.097, P=0.098). 3. TT genotype of MTHFR 677C>T increased the risk of NTG threefold [odds ratio (CC+CT vs. TT)= 3.25, 95% CI= 1.09-9.73)], and the both GT genotype and T allele of NOS3 894G>T decreased the risk about fivefold (GG vs. GT: odds ratio= 0.18, 95% CI= 0.04-0.90; G vs. T: odds ratio= 0.21, 95% CI= 0.04-0.97). 4. There were no signigicant association between SNPs of BDNF (601A>T, c.251C>T, IVS5-71T>A, c.758G>A) and Survivin (12000A>G, 12192C>T, 12614T>C) and NTG. In conclusion, these findings indicate that SNPs in the MTHFR and NOS3 are associated with NTG and the former is thought as a risk factor and the latter as a protective factor. Genetic determinants contributing alternation of vascular tone account for the disease. BDNF and Survivin may be excluded from primary risk factors of NTG. Further analysis of other genes for neuroprotection and stratified clinical analyses of NTG may help us to understand the pathogenetic role of these genes in NTG and have future implication in its treatment and prevention.