Molecular characterization of NBS-LRR class of resistance gene in apple

Abstract

식물은 수많은 병원균에 대응하기 위한 다양한 전략을 사용한다. 그 중에서 특정 병원균들을 감지할 수 있는 저항성 유전자에 의한 방어는 병원균의 avirulence 유전자를 ligand로 하여 인식하는 가장 효과적이고 뛰어난 전략이다. 지금까지, Arabidopsis나 작물에서 특이적 혹은 전반적인 저항성을 주도록 신호전달에 중요한 역할을 하는 특히 NBS-LRR 타입의 저항성 유전자에 대한 많은 연구가 있어왔다. 하지만 사과와 같은 과수의 저항성 유전자에 대한 연구는 미비한 편이다. 사과의 저항성 유전자에 대한 분자수준학적 이해를 하기위한 첫번째 단계로서, 사과의 새로운 NBS-LRR class의 저항성 유전자를 찾기 위한 probe를 확보하였다. 이미 알려진 저항성 유전자들의 conserved motif에 해당하는 부분을 degenerate primer로 제작하여 PCR 하여 NBS domain을 가진 resistance gene analogues (RGA)들을 선택하였다. 두 종류의 야생종 Malus prunifolia와 M. baccata, 두 종류의 품종 M. domestica cv. Fuji and M. domestica cv. Jonathan에서 11개의 서로 다른 RGA family들을 얻었다. 이들 RGA family들은 모두 발현되는 transcript였고, 두 종의 야생종과 두 종의 품종에 고루 분포하고 있다. 하지만 그들의 염기서열은 서로 매우 divergent 하다. 더욱이, RGA family내의 낮은 recombination을 보이는 것은 사과의 NBS-encoding sequence의 진화가 점차적인 돌연변이의 축적에 의한 것이며 recombination에 의한 것이 아님을 말해준다. 4 종류의 사과에서 발견된RGA family들의 높은 diversity에도 불구하고, 야생종과 품종간의 RGA의 분화가 잘 안된 것은 병원균에 대한 tolerance라는 다른 요인이 저항성을 갖는데 중요한 역할을 했음을 시사한다. 두번째로, 야생종 사과에서 새로운 저항성 유전자를 찾기 위해서, 1.4 x 10^6 pfu/μg of arms를 갖고, 평균 insert size가 1 kb이며, recombinant rate가 99%인 M. baccata의 cDNA library를 제작하였고, 확보된 RGAs를 probe로 하여 screen하였다. 두개의 저항성 유전자 후보를 분리하였고, MbR4와 MbR7으로 명명하였는데, 이들은 NBS-LRR type의 저항성 유전자였다. MbR4의 complete transcript 크기는 2243 nt이고, 2개의 intron과 3개의 exon으로 구성된 ORF의 크기는 2178 nt였다. 예상된 promoter region의 signal들은 TATA box (-35 region), GC box (-50 region) 와 CAAT box (-68 region) 이었다. TIR-NBS 구조를 지닌 MbR4은 726 개의 아미노산으로 구성되어있다. MbR7의 경우는, complete transcript 크기가 3606 nt였으며, 6개의 intron과 7개의 exon으로 구성된 ORF의 크기는 3294 nt였다. TIR-NBS-LRR 구조를 지닌 MbR7은 1095개의 아미노산으로 구성되어있다. MbR4와 MbR7으로부터 추론된 단백질은 담배의 TMV virus resistance gene N과 감자의 NL25 or NL27 gene과 가장 homology가 높았다. 이런 결과는 단일 식물 종 내에서 다양한 인식 특이성을 지닌 다른 종과의 유연 관계가 있는 저항성 유전자가 많이 존재함을 시사한다. MbR4와 MbR7의 기능성을 알아보기 위한 세번째 단계로, Pseudomonas syringae cv. tomato로 감염시킨 형질전환체 (35S::MbR4 and 35S::MbR7) 잎에서 bacteria의 성장 저해를 조사하였다. 대조구에 비해 MbR4와 MbR7의 형질전환체에서 강한 저해를 보였다. 또 다른 접근으로는, micro-arrayed hybridization이 병원균에 감염되기 전부터 이미 defense 관련 유전자들이 발현되어있음을 알 수 있었다. 즉, MbR4와 MbR7의 과다 발현으로 저항성을 유도하였다. 본 연구에서, 사과 야생종, M. baccata에서 새로이 밝혀진 2개의 NBS-LRR class의 저항성 유전자, MbR4와 MbR7에 대한 기초적인 연구가 사과의 저항성 유전자들의 다양성에 대한 이해를 제공할 뿐만 아니라, MbR4와 MbR7가 저항성 유전자로서 기능을 한다는 가능성을 제시하였다.;Plants utilize a variety of strategies to withstand attack of the huge assortment of pathogens. Among them, the active plant defense mediated by resistance genes (R-genes) that are able to detect the presence of specific pathogen races through perception of avirulence (avr)-derived ligand is one of the most effective and predominant strategies. So far, there have been many studies on R-genes, especially the nucleotide binding site leucine-rich repeat (NBS-LRR) class of sequences in several crop plants, which play a critical role of the initial signaling events, are held in common in specific and effective resistance. However, there are a few of identified NBS-LRR class of R-gene in fruit plants such as apple. As a first step to understand the molecular background of R-genes in apple, the NBS-encoding sequences disease resistance gene analogues (RGAs) were isolated in wild and cultivated apple species (Malus sp.) by PCR-based degenerated primer for two conserved motifs of known NBS-LRR class of R proteins. Eleven distinct families of RGAs were obtained in two wild apple species, Malus prunifolia and M. baccata, and two cultivated apple M. domestica cv. Fuji and M. domestica cv. Jonathan. These RGAs families were all expressed transcripts and evenly distributed within two kinds of wild and cultivated species. However, their sequences are very divergent from each other. Furthermore, the low occurrence of recombination detected within apple RGAs families supports the idea that the evolution of NBS-encoding sequences in apple species seems to involve the gradual accumulation of mutations not recombination. Despite the higher diversity of RGAs families found within four apple species, the lack of RGA differentiation between wild and cultivated apple species suggests that other factors, such as tolerance capacity to pathogen, might play an important role in the survivorship of wild type species. Secondly, to find novel R-gene from wild type apple, a cDNA library of M. baccata was constructed as 1.4 x 10^6 pfu/μg of arms, approximate average insert size was 1 kb, recombinant rate was 99% and screened with obtained RGAs as probes. Two R-gene candidates were isolated and named as MbR4 and MbR7, which were identified as the NBS-LRR class of R-gene. The complete transcript size of MbR4 was 2243 nt long and the size of ORF consisting of two introns and three exons was 2178 nt long. The predicted promoter signals also were identified as TATA box (-35 region), GC box (-50 region), and CAAT box (-68 region). The deduced amino acid sequence of MbR4 was 726-amino acids with the TIR-NBS-LRR structure. In MbR7, the complete transcript size was 3606 nt long and the size of ORF consisted of six introns and seven exons was 3294 nt long. MbR7 encoded 1095-amino acid protein with the TIR-NBS-LRR structure. The putative proteins encoded by MbR4 gene and MbR7 gene are most similar to the TMV virus resistance gene N of tobacco and NL25 or NL27 gene of potato. This similarity suggests that large repertoires of distantly related R-gene with diverse recognitional specificities are found within a single apple plant species. As third step to confirm the functionality of MbR4 and MbR7, the inhibition of bacterial growth was investigated in each of MbR4 and MbR7 transgenic overexpressed plants (35S::MbR4 and 35S::MbR7) leaves infected with Pseudomonas syringae cv. tomato. They show a strong inhibition of pathogen growth in their leaves comparative to the control plants. As other approach, the microarray-based expression profiling analysis supported that both transgenic plants already activates expression of defense-related or regulated genes before infection with pathogen. In a word, the overexpression of the MbR4 and MbR7 induced the resistance. In this study, the basis of studies on the novel NBS-LRR class of R-genes, MbR4 and MbR7, in apple wild type species, M. baccata, provided not only the understanding for diversification of R-genes in apple, including wild and cultivar species, but also possibility of functional contribution to the gene products of MbR4 and MbR7 as R protein.