The regulation of syndecan-4 mediated cytoskeleton organization

Abstract

Syndecan-4는 focal adhesion에 널리 존재하는 transmembrane heparan sulfate proteoglycan이다. 이러한 syndecan-4는 정상 세포가 Fibronectin에 놓일 때 integrin과 연합하여 focal adhesion과 stress fiber 형성을 조절한다. Syndecan-4의 multimer 상태는 자체의 기능 조절에 매우 중요한 역할을 한다. 더욱이 합성, 정제된 Syndecan 단백질은 sodium dodecyl sulfate (SDS)-resistant oligomer를 형성함이 보고된 바 있다. 본 논문에서는 gel filtration chromatography를 수행한 결과 Syndecan-4 cytoplasmic domain peptide (4L)가 펩타이드 간의 이온 결합에 의해 안정화된 dimer를 형성함을 밝혔다. 이와 더불어 여러가지 GST fusion Syndecan-4 mutants를 제작한 결과로부터 Syndecan-4의 SDS-resistant dimerization에 있어서 transmembrane domain 만으로도 충분함을 알 수 있었다. Syndecan-4의 cytoplasmic domain이 PIP₂와의 결합을 통해 PKC의 활성을 조절함은 널리 알려진 사실이다. 따라서 본 논문에서는 In Vitro PKC Assay를 수행한 결과 Syndecan-4의 PKC 활성 조절은 여러가지 PKC isozymes (PKCα, PKCβI, PKCβII, PKCγ, PKCδ, PKCε, PKCζ) 중 PKCα에 특이적이며 Syndecan-4 cytoplasmic domain의 oligomerization이 PKCα의 활성화에 중요함을 알아냈다. 이 시점에서 본 논문에서는 세포골격 형성에 있어서 Syndecan-4에 의해 매개되는 세포내 신호 전달을 보다 구체적으로 조사하고자 하였다. 생화학적 연구를 수행한 결과 oligomerized Syndecan-4 cytoplasmic domain이 세포골격 형성을 조절하는 여러가지 PIP₂ 결합 단백질들 중 α-actinin에 특이적으로 결합함을 알 수 있었다. 더욱이 Rat Embryo Fibroblast (REFs)의 1 % Triton X-100 insoluble fraction을 분리한 결과 Syndecan-4의 과발현은 α-actinin의 세포막으로의 이동을 야기시킴을 알 수 있었다. 또한 phosphogel-enrichment column을 이용한 연구결과로부터 정상적으로 자라는 REFs에서 α-actinin의 serine/threonine 잔기가 인산화 되어 있으며 Fibronectin으로의 초기 adhesion이 이러한 인산화를 증가시킴을 알 수 있었다. 결론적으로, Syndecan-4-PKCα 복합체가 α-actinin과 결합함으로써 인산화를 야기시키며 이러한 일련의 과정들이 focal adhesion과 stress fiber 형성 조절에 중요함을 알 수 있었다. 또한 이러한 과정에서 Syndecan-4의 oligomer 상태가 Syndecan-4 활성화에 매우 중요한 역할을 한다는 사실 또한 밝혔다.;The syndecan-4 is a widely expressed transmembrane heparan sulfate proteoglycan which localizes in focal adhesions. Upon plating on fibronectin, syndecan-4 functions as co-receptor for integrin, these two receptors cooperatively regulate focal adhesion and stress fiber formations. Previous studies show that both purified and recombinant core proteins form sodium dodecyl sulfate-resistant dimers. I now report that at physiological pH, syndecan-4 cytoplasmic domain peptide (4L) forms a dimer stabilized by ionic interaction between peptides through gel chromatography. Moreover the results using several GST fusion syndecan-4 mutants show that the transmembrane domain is sufficient for SDS-resistant dimerization of syndecan-4. It has been known that the cytoplasmic domain of syndecan-4 potentiates Protein Kinase C (PKC) activity through interaction with Phosphatidylinositol (4,5) bis-phosphate (PIP₂). In Vitro PKC Assay showed that PKC activation activity of syndecan-4 was specific to PKCα among several PKC isozymes (PKCα, PKCβI, PKCβII, PKCγ, PKCδ, PKCε, PKCζ). Oligomerization of syndecan-4 cytoplasmic domain was also critical of PKCα activity. Biochemical studies showed that oligomerized syndecan-4 cytoplasmic domain interacted with a-actinin, but no other known PIP₂ binding proteins in focal adhesions. Consistently overexpression of syndecan-4 caused localization of α-actinin into 1 % Triton X-100 insoluble fraction of Rat Embryo Fibroblast (REFs). Posphogel-enrichment column chromatography showed the serine/threonine phosphorylation of a-actinin. Therefore, the syndecan-4-PKCα complex interacts and induces phosphorylation of α-actinin to regulate focal adhesion and stress fiber formation. In addition, oligomeric status of syn decan-4 is critical to regulate the functions of syndecan-4.