TRAF-mediated ROS production in TRANCE receptor signaling complex

Abstract

Tumor necrosis factor (TNF)-related activation-induced cytokine인 TRANCE 와 TRANCE 수용체는 adaptor 단백질인 TRAFs과 결합 함으로써 전사 조절 인자인 NF-kB와 JNK를 활성화 시킨다. 다양한 TRAF 단백질 중에서 TRAF6는 TRANCE 수용체를 통한 신호전달에서 중요한 역할을 담당한다고 알려져있다. TRAF6의 mutational analysis를 통하여 TRAF6의 어느 부분이 TRANCE 수용체와의 결합과 NF-kB, JNK의 활성화에 필요한지 조사하였다. Point mutants와 Truncated mutants를 가지고 실험한 결과 RING finger 와 Zinc finger의 경우 NF-kB의 활성화에는 반드시 필요하지 않으나, JNK의 활성화에는 모두 반드시 필요하다는 것을 알 수 있었다. 또한 K477 residue는 TRANCE 수용체와의 결합을 통한 NF-kB를 활성화 시키는 데에 중요하고, R400 residue는 JNK를 활성화 시키는데 중요한 역할을 하는 residue임이 보여졌다. TRANCE 자극에 의해 유도되는 활성 산소종 (Reactive Oxygen Species, ROS)의 생성에 있어서 TRAFs이 어떠한 역할을 하는지 알아보기 위하여 TRANCE 수용체가 다량 발현되는 시스템을 사용하였다. 이 시스템에서 TRANCE 수용체의 발현은 tetracycline에 의해 조절 되어진다. 실험결과, TRAF2와 TRAF6의 Dominant negative form은 각각 TRANCE에 의한 ROS 생성을 막았고 이것은 ROS 생성에 있어서 TRANCE 수용체의 cytoplasmic tail에 TRAFs의 결합이 반드시 필요하다는 것을 제시한다. TRAF2의 경우 미토콘드리아에서 생성되는 ROS 조절에 관여하고, TRAF6의 경우 미토콘드리아 뿐만 아니라 plasma membrane의 ROS 생성을 조절하는데 역할을 하는 것으로 보여졌다. 또한 TRANCE 자극에 의한 MAPK와 NF-kB의 활성화는 ROS scavenger인 N-acetly cysteine (NAC) 처리에 의해 inhibit 되었다. 이러한 결과는 TRANCE 신호전달의 활성화에 TRAF에 의해 생성된 ROS가 매우 중요한 역할을 하고 있음을 말해준다.;Tumor necrosis factor (TNF)-related activation-induced cytokine, TRANCE and its receptor, TRANCE-R, activate nuclear factor κB (NF-κB) and the c-Jun N-terminal kinase (JNK) pathways through their interaction with TNF receptor-associated factors (TRAFs). Among TRAF family proteins, TRAF6 plays a key role in transducing signals of TRANCE-R. Through a detailed mutational analysis of TRAF6, I have examined the requirements for NF-κB and JNK activation and interaction with TRANCE-R involved in TRANCE signaling. Examination of points and truncated mutants indicates that RING finger and zinc finger are solely required for full activation of JNK but not essential for activation of NF-κB. K477 residue of TRAF6 is responsible for activation of NF-κB through the interaction with TRANCE-R, while R400 residue is responsible for activation of JNK. To investigate the roles of TRAFs in TRANCE-induced reactive oxygen species (ROS) production, I adopted a tightly regulated, high-level TRANCE-R expression system under the control of tetracycline. The dominant negative forms of TRAF2 and TRAF6 significantly blocked production of ROS by TRANCE, suggesting the recruitment of TRAFs to the cytoplasmic tail of TRANCE-R is crucial for ROS production. Moreover, TRAF2 regulates ROS production in mitochondria, whereas TRAF6 in both mitochondria and plasma membrane. Importantly, TRANCE-induced MAP kinase and NF-κB activation were significantly inhibited by the treatment of N-acetyl cysteine (NAC), suggesting TRAF-mediated ROS production may play important roles in the activation of TRANCE signaling.