The binding partners of LAST, Lck-associated signal transducer

Abstract

Src homology 2 (SH2) domain은 세포내 신호전달에 관련하는 여러 단백질에 존재하는 domain으로서, 활성화된 receptor 또는 신호전달 단백질의 phosphotyrosine을 포함하는 특정 motif에 특이적으로 결합한다. 이런 이유로, SH2 domain에 결합하는 신규 단백질을 규명하는 것은 세포신호전달 체계의 연구에 있어서 매우 중요하다고 생각되어져 왔다. 앞서 우리는 Lck의 SH2 domain에 결합하는 단백질 중 하나로서 LAST (Lck-Associated Signal Transducer) 를 tyrosine phosphorylation-dependent yeast two-hybrid system을 이용해 찾아낸 바 있다. In vivo에서의 LAST의 기능을 알아내기 위해 이 단백질의 발현 양상을 여러 가지 세포주에서 시험해 본 결과, LAST가 T cell lines (D1.1과 H9), epithelial cell lines (293T과 HeLa) 및 fibroblasts (NIH3T3과 Cos-7)에서 발현되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 여러 조직에서의 발현 양상을 시험해 본 결과, LAST가 Heart 와 skeletal muscle에서 발현되는 것을 확인하였다. 비록 이렇게 일부 조직에서만 발현되는 것으로 나타나긴 하였지만, 이전의 Northern analysis 결과와 세포주에서의 발현 양상으로 미루어 보아 LAST는 ubiquitous하게 발현되는 것으로 생각되어진다. 이와 같은 발현 양상은 LAST가 면역관련세포뿐만 아니라 다른 세포 또는 조직에서도 Src family kinase와 결합하여 그 고유의 역할을 수행할 수 있다는 가능성을 간접적으로 제시해준다. 그 다음, LAST의 기능을 좀더 구체적으로 규명하기 위해 LAST와 Src kinase domain의 hybrid를 bait로 하여 LAST에 결합하는 단백질들을 tyrosine phosphorylation-dependent yeast two-hybrid system응 통해 찾고자 하였다. Ubiquitous하게 발현되는 LAST의 특징 때문에 LAST를 phosphorylation 시키기 위한 상대 단백질로서 Lck가 아닌 Src를 bait에 포함시켰다. Screening 결과 나온 후보 단백질들을 Src family kinases, 그 외 SH2 domain을 가지는 단백질들, 그리고 그밖에 SH2 domain을 포함하지 않는 단백질 등 세 가지 군으로 분류하였다. SH2 domain을 가지는 단백질들에는 CIS, Grb10, Nck-2, PI3-kinase, Sck, SH2-B, Slap, STAP-1, STAT 5A, 및 Vav가 포함되어 있는데, 그 중에서도 PI3-kinase, SH2-B, STAP-1가 반복적으로 나타났다. 한편, LAST knock-out mice를 만들기 위한 targeting vector를 construction하기 위해 genomic DNA library screening을 수행하였다. 그리고 restriction enzyme site mapping을 통해, LAST genomic DNA상에서의 exon의 위치를 규명하였다.;Src homology 2 (SH2) domains are found in a variety of intracellular signaling proteins and bind specific phosphotyrosine-containing motif on activated receptors and signaling proteins. Therefore, the identification of SH2 domain-binding proteins is a key step to research signaling cascades (1). We have previously identified LAST (Lck-Associated Signal Transducer) as the binding partner of the Lck/Src SH2 domain in a tyrosine phosphorylation-dependent yeast two-hybrid system. To study the function of LAST in vivo, the expression pattern of LAST was observed in various cell lines. LAST was detected in T cell lines (D1.1, H9), epithelial cell lines (293T, HeLa) and fibroblasts (NIH3T3, Cos-7). Although LAST was expressed only in heart and skeletal muscle in the tissue distribution study, it is thought that LAST is expressed ubiquitously. To determine the subcellular localization of LAST, cytoplasmic, membrane and nuclear fraction of the human T cell leukemia D1.1 cells was examined. LAST was localized in t he cytoplasmic and membrane fraction, but not in the nuclear fraction. These results suggest that LAST may act as an adaptor molecule that involves in multiple signaling pathways as well as T cell antigen receptor signaling. To further characterize the functions of LAST, LAST-binding proteins were searched using hybrid of LAST and Src kinase domain (LAST-Src K) as bait. In the bait, the kinase domain of Src, rather than Lck, was included to identify binding-partners of LAST that was expressed ubiquitously. We found several potential LAST-binding proteins that contain SH2 domain, including Src family kinases. As SH2 domain-containing proteins, CIS, Grb10, Nck-2, PI3-kinase, Sck, SH2-B, Slap, STAP-1, STAT 5A, and Vav were detected. Out of them, PI3-kinase, SH2-B and STAP-1 were repeated. In addition, the proteins, which do not contain SH2 domain, were also detected. Further, we performed genomic library screening and restriction enzyme-site mapping for targeting vector construction to generate knockout mice of LAST.