녹용의 Acetylcholinesterase 활성 저해 성분의 정제 및 구조분석

Abstract

고령인구가 증가할수록 치매 환자의 수도 증가되어 최근에는 치매와 치매를 일으키는 주 질병인 알츠하이머씨 병(Alzheimer's disease)의 원인과 치료가 관심의 대상이 되었다. 몇몇의 학자들은 뇌세포에서 오는 알츠하이머 형태의 소 섬유화(fibrillary change), 노인성 반(senile plaque), 그리고 아밀로이드(amyloid) 축적은 인체신경계 노화현상의 기본적 변화이며 이런 변화가 악화되는 것은 알츠하이머씨 병-노인성치매 복합(Alzheimer's disease-senile dementia complex)의 변화라고 주장한다. 병리약물학적 연구로 콜린성 결핍 (cholinergic deficit)이 병의 주원인이라는 기본원리에서 알츠하이머씨 병의 효과적인 치료를 위한 연구가 시작되었다. 콜린성 신경 전달의 지표 (cholinergic neurotransmission marker)인 acetylcholine esterase의 증가와 choline acetyltransferase의 부족이 알츠하이머씨 병에서 뚜렷이 나타나는 점과, 동물 실험에서 콜린계의 변화는 학습과정의 장애를 가져온다는 것을 발견하였다. 콜린성 및 노어 아드레날린성 약제를 알츠하이머씨 병의 치료에 사용하고 있으나 이직 초기 단계이며 더욱이 이들이 상호 작용하여 심혈관계에 예상하지 못한 영향을 끼치는 것이 문제점으로 대두되고 있다. 녹용 추출물이 항노화 작용을 하며 고령의 쥐에서 기억능력과 학습능력을 증진시킨다는 연구보고 및 치매와 관련되어 신경이나 효소에 관계가 있을 것이라는 기존의 연구에 기초하여 녹용 추출물의 생리활성을 검색하였다. 본 연구에서는 녹용성분 중 acetylcholinesterase를 저해시키는 물질을 정제, 구조분석하였으며 acetylcholinesterase의 저해도를 측정하였다. 녹용 성분 분리는 다단계 용매 추출법을 사용해 hexane, chloroform 및 70% ethanol으로 추출하였다. 녹용의 chloroform 추출물이 쥐로부터 분리한 acetylcholinesterase의 활성을 크게 저해시켰으므로 추출물을 silica gel column chromatography 정제하면서 단계별로 정제도를 확인하였다. 동시에 acetylcholinesterase의 저해 효과를 측정하였는데 최종 정제 물질은 1mM의 농도에서 84%의 저해도를 나타내었다. 이것을 NMR spectroscopy, IR spectroscopy, FAB-MS를 사용하여 구조분석 한 결과 분자량이 812, 786인 sphingomyelin(24:1, 22:0)임을 확인하였다. Acetylcholinesterase와 butylcholinesterase의 저해 실험 결과 acetylcholinesterase의 저해 효과가 선택적임이 확인되었다. 또한 효소의 반응속도를 실험한 결과 sphingomyelin은 acetylcholinesterase에 대해 비경쟁적 저해제임을 알 수 있었다.;The most consistent features of the Alzheimer's Disease was reported acetylcholine depletion, amyloid βprotein aggregation. The prevention of the breakdown of acetylcholine by acetylcholinesterase inhibitors has the best clinically therapeutic efficacy for Alzheimer's disease patients. The known anti-aging effect of deer antler has led us to study on the acetylcholinesterase inhibitory activity. Acetylcholinesterase was isolated from the brain of rat and acetylcholinesterase inhibition was measured by a colorimetric method. We found that a chloroform extract of deer antler (Cervus Elaphus) showed a significant inhibitory effect on acetylcholinesterase activity. Chloroform extracts were purified by silica gel column chromatography and CE-C-12-F-f-I was obtained as the effective component. The acetylcholinesterase activities were investigated in each fraction of purification steps. Chloroform extracts showed about 52% significant inhibitory effects and CE-C-12-F-f-I showed about 84% significant inhibitory effects on the acetylcholinesterase activity. The structure of isolated compound was identified by spectroscopic parameters of ¹H-NMR,^13C-NMR, Homo-COSY NMR, Hetero-COSY NMR, Dept-NMR, IR, EI-MS, GC-MS, FAB-MS. The structure of CE-C-12-F-f-I is a sphingomyelin. Acetylcholinesterase and butylcholinesterase inhibition for sphingomyelin were measured by a colourimetric method. The result demonstrated t he sphingomyelin was selective inhibitor. A Lineswieber-Buck plot for sphingomyelin indicated a pattern of inhibition of acetylcholinesterase of the non-competitive type.