Local accumulation of hydrogen peroxide in centrosome through peroxiredoxin I phosphorylation by cdk1 is required for mitotic entry

Abstract

PrxI is phosphorylated on Thr 90 by Cdk1, a mitotic kinase and inactivated in HeLa cells(1). The PrxI phosphorylation was observed during mitosis but virtually undetectable during interphase. Here we show that the threonine phosphorylation is specific to PrxI associated with centrosome by immunoblot analysis of isolated centrosome fractions and the use of confocal microscopy. The local inactivation of PrxI would permit transient accumulation of H2O2 around centrosome, in which many cell cycle proteins including Cdk1, Cdc14B, and Cdh1 are located. Upon exposure of cells to low levels of H2O2, Cdc14B undergoes a reversible inactivation as the result of disulfide formation between the Cys-314 and Cys-228. Flow cytometry analysis using hydrogen peroxide sensor, Hyper, revealed that the levels of intracellular hydrogen peroxide fluctuate during cell cycle progression and rise to the highest in mitotic stage. The reduction of hydrogen peroxide in centrosome by the overexpression of centrosome targeting catalase inhibited mitotic entry and Cdk1 activation around centrosome at the transition stage from G2 to M, indicating the local accumulation of hydrogen peroxide around centrosome is a key factor for mitotic entry. Based on the results, we propose a model illustrating the significance of centrosome specific PrxI phospho-inactivation. In centrosomes of cells at the stage of entry into mitosis, Cdk1 is partially activated following cyclin B accumulation and phosphorylates PrxI, thereby inactivating PrxI. The PrxI inactivation would lead to accumulation of H2O2 around the centrosome, which promotes inactivation of Cdc14B. Consequently, Cdh1, a substrate of Cdc14B, remains phosphorylated and thereby detached from anaphase promoting complex/cyclosome(APC/C). Because APC/C complex requires its association with cdh1 for Plk1 and cyclin B ubiquitination activity, inactivation of Cdc14 B thus prevents the degradation of Polo-like kinase1 (Plk1) and cyclin B and the decay of Cdk1 activity during mitotic phase. In this study, we present that hydrogen peroxide is an important positive factor for centrosomal Cdk1 activation at the G2 to M transition and required for mitotic entry.;이전 연구에서 PrxI은 HeLa cell에서 mitotic kinase인 Cdk1에 의해서 threonine 90번 잔기가 인산화 됨으로 인해서 불활성화가 된다는 사실이 보고 되어진 바 있다. PrxI의 인산화는 세포 주기 중 세포분열기에서 관찰이 되며, 간기 동안에는 관찰되지 않는다. 이 결과에서 우리는 PrxI 의 threonine 90번 잔기의 인산화가 세포의 중심체에서 특이적으로 일어난다는 사실을 중심체 분리를 통한 실험 방법에서 뿐만아니라 HeLa cell, A431, MCF7 cell에서 공초점 현미경을 이용한 관찰을 통해서 알 수 있었다. PrxI의 국소적인 불활성화는 많은 세포 주기 조절 단백질들이 위치하고 있는 중심체 주변에 일시적인 활성산소(H2O2)의 농도를 증가시키게 된다. 세포가 낮은 농도의 활성 산소에 노출되게 되면 탈 인산화 효소인 Cdc14B의 cysteine 314번 잔기와 228번 잔기 사이에 이황화 결합이 형성이 되어 가역적인 불활성화를 초래하게 된다. 활성 산소 탐지 센서인 Hyper plasmid와 세포 유속 분석기를 이용해서 세포 내 활성산소의 양이 세포 주기가 진행하는 동안에 증가와 감소가 일어나고, 특히 세포분열기 단계에서 가장 높은 양의 활성산소가 존재한다는 것을 알 수 있었다. 중심체로 이동하게 만들어진 catalase를 이용하여 중심체에서 활성 산소를 인위적으로 감소시키면 mitotic entry를 저해하고 G2에서 세포분열기로 전이되는 단계에서 중심체 주변의 Cdk1활성이 저해된다. 이를 통하여 중심체 주변의 국소적인 활성 산소의 축적이 mitotic entry를 위해서 중요하다는 사실을 알게 되었다. 이러한 결과를 바탕으로 우리는 중심체에서 특이적으로 PrxI의 인산화로 인해 불활성화 되어 축적되는 H2O2와 Cdk1의 활성화를 중심으로 새로운 모델을 제시하였다. Mitotic entry를 위하여 세포의 중심체에서는 cyclinB의 축적에 따라 Cdk1이 부분적으로 활성화되어 PrxI이 인산화되고, 이러한 PrxI의 불활성화는 중심체 주변에 일시적인 활성 산소의 축적을 야기하여 Cdc14B를 불활성화 시키게 된다. 결과적으로 Cdc14B의 기질인 Cdh1은 인산화되어 APC/C (Anaphase Promoting Complex/Cyclosome)으로부터의 결합이 떨어져 불활성화 된다. APC/C는 Plk1(Polo-like kinase1)과 cyclin B의 ubiquitination 활성을 위하여 cdh1과의 결합이 필수적인데 상위에서 Cdc14B의 불활성화로 인하여 Plk1과 Cyclin B가 분해되지 않고 축적되어 cdk1역시 활성을 가지게 된다. 이 연구에서는 활성 산소가 G2에서 세포분열기로의 전이에서 중심체의 Cdk1의 활성에 중요한 요소로 작용한다는 사실을 증명하였다.