Development and evaluation of Respiratory Syncytial Virus vaccine candidates targeting RSV G and F proteins

Abstract

Respiratory syncytial virus (RSV) is a major cause of severe lower respiratory tract disease in infancy and early childhood. Despite its importance as a pathogen, there is no licensed vaccine to prevent RSV infection. The G glycoprotein of RSV, a major attachment protein, is a potentially important target for protective antiviral immune responses and has been shown to contain chemotactic activity through CX3C mimicry. The fusion (F) protein of RSV is also a potentially important target for protective antiviral immune responses. In this study, to develop safe and potent vaccines, I have targeted two major surface glycoprotein of RSV, G protein and F1 protein (amino acid residues 155-524). Using these target proteins, I have designed several RSV vaccine candidates and evaluated their efficacy. The first immunogen is RSV G core fragment (Gcf) from RSV G amino acid 131-230, which was expressed in E. coli. Next immunogen is a baculovirus-based vaccine, RSV G displaying baculovirus (Bac-RSV G), which are baculovirus particles that express RSV G proteins from insect cells. The final immunogen is recombinant replication-defective adenovirus that expresses RSV F (rAd/Fco), and secretory signal sequence was added to enhance the F protein expression in animal cells. Here, I show that sublingual or intranasal immunization of purified G protein core fragment induces strong serum IgG responses. Interestingly, these antibody responses could be elicited even in the absence of any adjuvant. In vitro assay shows that Gcf has potent chemotactic activity, suggesting a role as an adjuvant itself. Mucosal immunization with Gcf also provides protection against RSV challenge without any significant lung eosinophilia or vaccine-induced weight loss. Intranasal immunization of Bac-RSV G also has the best potential to protect against RSV infection. Strong serum IgG and mucosal IgA responses were induced by intranasal immunization with Bac-RSV G. In addition to humoral immunity, G-specific Th17- as well as Th1-type T-cell responses was detected in the lungs of Bac-RSV G-immune mice upon RSV challenge. Neither lung eosinophilia nor vaccine-induced weight loss were observed upon Bac-RSV G immunization and subsequent RSV infection. I examined the immune responses elicited by recombinant replication-deficient adenovirus (rAd)-based vaccines expressing the soluble F1 fragment of F protein (amino acids 155 to 524) in murine model. The expression of secreted F1 fragment by rAd was significantly increased by codon optimization. Strong mucosal IgA response was induced by single intranasal immunization of codon-optimized vaccine, rAd/F1co, but not by rAd/F1wt. A single intranasal immunization with rAd/F1co provided potent protection against subsequent RSV challenge. Interestingly, neither serum Ig nor T-cell response directed to F protein was detected in the rAd/F1co-immune mice, suggesting that protective immunity by rAd/F1co is mainly mediated through mucosal IgA induction. Indeed, co-delivery of cholera toxin B subunit significantly enhanced mucosal IgA responses by the optimized vaccine, which correlates with protective efficacy. Together, my data demonstrate that mucosal administration of vaccine expressing RSV proteins elicits protective immunity and represents a promising vaccine candidate against RSV infection.;Respiratory syncytial virus (RSV)는 전 세계적으로 영 유아의 하부 호흡기 질환을 일으키는 주요 원인 병원체로 면역력이 저하된 환자나 노인에게도 감염되어 심각한 호흡기 질병을 앓게 한다. 또한 영•유아기의 RSV 감염은 추후에 폐 기능 저하와 천식을 유발시킬 수 있다는 점에서 그 심각성이 크다. 이러한 바이러스가 질병을 일으키는 중요한 병원균임에도 불구하고 현재까지 임상 사용이 허가된 RSV 백신은 없다. Glycoprotein (G) 과 Fusion (F) 단백질은 RSV의 표면에 존재하는 대표적인 2가지 당 단백으로 바이러스에 대한 면역반응을 유도하기 위한 좋은 표적이 될 수 있다. 따라서 안전하고 효과적인 RSV 백신을 개발하기 위해 각각 RSV G 단백질 또는 RSV F 단백질 (아미노산 잔기 155-524) 을 다양한 시스템을 이용하여 발현시키고 그 효능을 검증하였다. 먼저 RSV G의 조각 (아미노산 잔기 131-230)을 표적으로 하여 박테리아에서 발현시킨 단백질 (Gcf)을 정제하여 백신으로 사용하였다. Gcf 백신은 점막 면역화를 통해 RSV 감염 시 RSV 복제에 대한 효과적인 방어를 나타내었다. Gcf 백신은 매우 높은 혈청 IgG와 호흡기 점막 IgA를 유도할 수 있었다. 또한 RSV G 단백질 아미노산 서열 183 에서 195까지 의 I-Ed-restricted immunodominant epitope 에 의해 나타나는 Th 1 유형의 CD4 T 세포 반응이 Gcf 또는 Gcf/CT에 의해 유도되었으며, 반면 염증반응을 일으킬 수 있는 Th 2 세포반응은 유도되지 않았다. 이 연구에서 주목할 만한 것은 Gcf가 어쥬번트 없이 이러한 면역반응을 일으켰다는 것이고 이는 G 단백질에 있는 CX3C motif에 의한 chemokine의 반응에 의한 것이라는 것을 알 수 있었다. 다음으로 재조합 배큘로 바이러스를 이용한 RSV 백신 후보물질을 제작하기 위하여 RSV G 단백질 전체를 배큘로 바이러스 표면에 발현시킨 후 쥐 실험 모델을 이용하여 면역반응을 연구하였다. 두 번의 면역 후 쥐의 혈청으로부터 Ig 을 측정한 결과, Bac-RSV G 그룹에서 높은 혈청 Ig가 유도되었으며, RSV 감염 후에는 점액성 중화 IgA도 크게 증가하는 것으로 나타났다. 또한 Bac-RSV G 면역 쥐에서는 RSV 감염 후 Th 1 유형의 CD4 T 세포 반응뿐만 아니라 Th 17 유형의 CD4 T 세포 반응도 나타났다. 그리고 Bac-RSV G 역시 Th 2 유형의 CD4 T세포 반응이 나타나지 않았고, 백신으로 인한 무게 감소나 폐의 호산구 역시 나타나지 않았다. 마지막으로 쥐 실험 모델에서 비복제 재조합 아데노바이러스를 이용하여 F 단백질의 F1부분 (아미노산 155-524)을 발현시켜 면역반응을 유도하는 연구를 수행하였다. Codon 최적화를 하여 F1부분의 발현을 높이고 발현된 단백질이 밖으로 분비될 수 있게 rAd/F1co을 제작하였다. 제작한 rAd/F1co는 한 번 비강투여로 점액성 중화 IgA를 유도하였으며, RSV 감염 시 혈청 immunoglobulin이나 CD8 T 세포 반응을 유도하지 않으면서 백신에 의한 질병 없이 효과적으로 바이러스로부터 숙주를 보호하였다. 더 적은 양의 백신으로 방어효율을 높이기 위해서 각각 1x107 PFU 의 rAd/3xG, rAd/Fco 그리고 M2 단백질을 발현하는 아데노바이러스 백신, rAd/M2를 섞은 혼합백신을 만들어 방어효율을 조사하였다. 그 결과 이 혼합백신은 rAd/3xG 나 rAd/Fco를 단독으로 면역화시켰을 때보다 더 좋은 방어효율을 보였다. 즉, RSV G와 F 단백질은 RSV 백신 개발에 좋은 표적이 될 수 있음을 시사하였고, 또한 다양한 시스템을 통해 제작한 각각의 백신은 점막 경로를 통해 면역화 하였을 때 바이러스를 완전하게 막을 수 있었으며 백신에 의한 어떠한 무게감소나 염증에 관련된 세포 반응도 유도하지 않았다. 따라서 본 연구결과에서 소개된 백신 후보물질은 RSV에 대해 효과적인 백신으로의 가능성을 제시한다.