말초혈액을 이용한 염색체 분석과정의 최적조건에 관한 연구

Abstract

최초로 식물을 재료로 하여 염색체 분석이 이루어진 이후로 Tjio와 Levan(l956)에 의해 인류염색체 수가 46개로 정확하게 밝혀졌고, 1960년대 이후부터는 인류염색체에 관한 연구가 집중적으로 진행되어 왔다. 염색체는 세포주기에 따라 분열을 거듭하게 되고 이러한 세포주기에 따른 적절한 시약의 사용은 핵 내의 염색체를 분석할 수 있는 상태로 만들어 낼 수 있다. 인류의 많은 질환이 비정상적인 염색체 조성에 의한 결과라는 보고가 임상에 적용되면서 세포유전학 분석이 인류의 유전질환에 있어 중요한 분야로 자리잡게 되었다. 말초혈액을 이용한 염색체 회수과정에서 적절한 시약의 사용은 최종적으로 분석하는 염색체의 질에 영향을 마친다. 본 연구에서는 말초혈액을 이용하여 인류염색체의 분석을 보다 용이하게 관찰할 수 있는 조건을 알아보기 위해 phytohaemagglutinin과 colcemid, ethidium bromide는 여러 가지 농도별로 또 저장액처리과정은 노출시간변이에 따라 실험하였고 그 결과는 다음과 같다. 1. 세포분열을 유도하는 phytohaemagglutinin 최적농도를 알아보는 실험에서, 농도변이 7㎕/㎖, 15㎕/㎖, 30㎕/㎖, 60㎕/㎖, 100㎕/㎖중 배양액에 처리하여 전체 회수된 세포중 유사분열 중기 세포가 차지하는 비율로 최적농도를 알아 본 결과 phytohaemagglutinin 15㎕/㎖에서 가장 높은 유사분열 중기세포의 회수율을 얻을 수 있었다. 2. 유사분열억제제인 colcemid의 최적 농도를 알아보는 실험에서, 최종 농도 변이 는 0.01㎍/㎖, 0.02㎍/㎖, 0.05㎍/㎖, 0.1㎍/㎖, 0.2㎍/㎖, 0.4㎍/㎖ 이었고, 이 중 0.05㎍/㎖이 유사분열 중기 상태면서 염색체간 겹침이나 꼬임이 많지 않아 염색체 분석에 적당한 상태의 염색체를 많이 얻을 수 있었다. 3. 세포내로 저장액의 유입을 유도하여 세포내 염색체의 간격을 일정하게 유지시키는 역할을 하는 저장액(0.075M KCI)에의 노출 시간변이는 10분, 20분, 30분,40분, 60분이었고, 그 결과 20분에서 염색체가 서로 많이 뭉치지도 흩어지지도 않은 적당한 분포상태를 유지함을 볼 수 있었다. 4. 기본적인 염색체 회수과정에 더하여 미세한 band를 얻기 위한 과정으로 ethidium bromide의 첨가농도에 관한 실험을 하였는데, 이 때 colcemid의 최종농도는 0.02㎍/㎖로 고정하였고, ethidium bromide의 농도변이는 5㎍/㎖, 7.5㎍/㎖, 10㎍/㎖, 20㎍/㎖ 이었다. 그 결과 colcemid 최종농도 0.02㎍/㎖ 처리 전에 ethidium bromide 5㎍/㎖이나 7.5㎍/㎖을 처리함으로써 미세band의 분석이 가능한 긴 염색체의 회수율이 높아짐을 알 수 있었다. 이상의 실험결과를 종합해 보면, 말초혈액을 이용한 인류염색체 분석과정에서 phytohaemagglutnin 15㎍/㎖, colcemid 0.05㎍/㎖, 20분간의 저장액 노출이 각 과정에서 조화를 이루어 처리되었을 경우, 분석에 적합한 상태의 염색체 회수가 이루어졌다. 만일 좀 더 많은 band를 보아야 할 경우에는 동일조건의 phytohaemagglutnin, 저장액처리와 함께 0.02㎍/㎖ colcemid에 5㎍/㎖이나 7.5㎍/㎖의 ethidium bromide의 첨가시 분석 가능한 긴 염색체의 회수율이 높아짐을 알 수 있었다.;Human chromosome number was exactly discovered in 1956 as 46 by Tjio and Levan since chromosomal analysis had been accomplished from plant material for the first time, and the investigations for chromosomes have been proceeding intensively from the 1960s. Chromosomes continue cell divisions and the application of proper chemical agents according to cell cycles becomes possible to analyse chromosomes in the cell. Cytogenetics analysis was occupied in the important field of human genetic diseases as the report that the many diseases of human are the result of abnormal chromosomal constitution had been applied. This study intended to find out the optimal conditions of human chromosomal analysis protocol in peripheral blood sample. The experiments were made with the variations of phytohaemagglutinin, colcemid, ethidium bromide concentration and the variations of hypotonic solution exposure time. The results are as follows. 1. In the experiment on the optimal phytohaemagglutinin concentration, the variations of concentration were 7㎕/㎖, 15㎕/㎖, 30㎕/㎖, 60㎕/㎖, 100㎕/㎖. Among these concentration variations, the highest mitotic index in the overall collected cells was obtained in phytohaemagglutinin concentration 15㎕/㎖. 2. In the experiment on the concentration of mitotic arrestant colcemid, the variations of concentration were O.O1㎕/㎖, 0.02㎕/㎖, 0.05㎕/㎖. O.1㎕/㎖. 0.2㎕/㎖, 0.4㎕/㎖. The proper chromosomal state that is meta phase stage and doesn't have many chromosomal crossings or tangles was obtained in colcemid concentration 0.05㎕/㎖. 3. In the experiment on the optimal exposure time of hypotonic solution (0.075M KCl) treatment, the variations of exposure time were l0mins, 20mins, 30mins, 40mins, 60mins. Chromosomal states were analysed in accordance with chromosomal distribution rate. The most suitable intervals between chromosomes were subtained in 20mins. 4. In the experiment on the optimal concentration of ethidium bromide to obtain minute chromosomal bands, the variations were O㎕/㎖, 5㎕/㎖, 7.5㎕/㎖, l0㎕/㎖, 20㎕/㎖. Among these variations, the best result was when ethidium bromide concentration 5㎕/㎖ or 7.5㎕/㎖ was addition to colcemid concentration 0.02㎍/㎖. These results indicate that the combination of phytohaemagglutinin 15 ㎕/㎖, colcemid 0.05㎕/㎖, hypotonic solution exposure time for 20mins is important to the collection of appropriate chromosome state in human chromosomal analysis using peripheral blood. In the case that needs to obtain minute bands, the elongated chromosomes are obtained when ethidium bromide 5㎕/㎖ or 7.5㎕/㎖ in addition to colcemid concentration 0.02㎕/㎖ with the same conditions of phytohaemagglutinin and hypotonic solution.