유방의 침윤성 관암종에서 PTEN 발현 소실에 관한 연구

Abstract

Purpose: PTEN is a novel tumor suppressor gene, located on chromosome 10q23.3. A high frequency of mutations at PTEN locus has been described in a variety of neoplasms. The detection of PTEN mutations in Cowden disease suggests that PTEN may be involved in mammary carcinogenesis. The incidence of loss of heterozygosity of PTEN is approximately 10 to 40% in sporadic breast cancers, but intragenic mutation of PTEN is less than 1%. As one of the mechanisms for gene silencing, methylation of PTEN promoter region is suggested. The purpose of our study was to evaluate loss of expression of PTEN by immunohistochemistry and methylation specific PCR, and to correlate between loss of PTEN expression and clinicopathologic variables in invasive ductal carcinoma of the breast. Methods: The immunohistochemical stain with an anti-PTEN protein antibody(monoclonal mouse anti-human PTEN[A2B1], Santa Cruze Biotech, Santa Cruz, USA) was performed on formalin-fixed paraffin embedded breast tissues from 129 women with diagnosis of invasive ductal carcinoma. The staining was interpreted as loss of PTEN expression when less than 5% of tumor cells expressed PTEN. DNA was extracted from 28 cases with loss of PTEN expression. Polymerase chain reaction, using the modified tumor DNA by treatment with sodium bisulfite and two primer sets(one specific for the unmethylated sequence and the other for the methylated sequence), was performed to detect the methylation of a CpG island in the PTEN gene. Results: Sixty-two(48%) of 129 breast tumors had loss of PTEN expression. Loss of PTEN expression correlated with lymph node metastasis (p=0.046), high stage(p=0.049), and peritumoral lymphovascular invasion(p=0.022). Loss of PTEN expression did not correlate with age, tumor size, nuclear grade, histologic grade, estrogen receptor, progesterone receptor, c-erbB-2, and p53. There is PTEN promoter methylation in five(18%) of 28 patients. PTEN methylation correlated with tumor size(p=0.048) and stage(p=0.022). Conclusion: These results suggest that loss of PTEN expression plays a role in the progression of breast cancer and an aberrant promoter methylation is one of the silencing mechanisms of PTEN.;유방암은 여성에서 흔히 발생하는 종양으로, 국내에서는 위암에 이어 두번째(15.1%)로 흔한 여성의 악성 종양이며 그 빈도가 매년 증가하는 추세이다. 유방암은 종양유전자와 종양억제유전자의 활성 또는 비활성에 의해 일어난 변화가 축적되면서 다단계의 유전적 과정을 거쳐 진행하므로, 종양의 침습과 전이에 필요한 유전자들에 대한 연구는 예후를 결정하고, 치료를 개발하는 데 도움이 될 것이다. PTEN/MMAC(phosphatase and tensin homologue deleted in chromosome ten/mutated in multiple advanced cancers)는 염색체 10q23.3에 위치한 종양억제유전자로, 그 단백 산물은 P13K(phosphatidyl inositol-3-kinase)/Akt 경로에 작용하여 세포의 증식과 생존을 조절하고 FAK(focal adhesion kinase)를 통한 세포의 이동과 침윤을 방지하여 종양 생성을 억제한다. Cowden 질환과 연관된 유방암의 30-50%에서 PTEN의 내림물려받기 돌연변이(germline mutation)가 있고, 산발성 유방암의 10-40%에서 PTEN의 이형접합성소실(loss of heterozygosity)이 관찰된다. 그러나 산발성 유방암에서 PTEN유전자 자체의 변이나 결손은 1% 이하에서 관찰되어, 다른 기전에 의해 PTEN유전자 자체의 변이나 결손은 1% 이하에서 관찰되어, 다른 기전에 의해 PTEN이 비활성화 될 수 있음을 시사한다. 종양억제 유전자의 DNA 촉진염기서열(promoter) 부위에 CpG island의 cytosine이 메틸화되면 종양억제유전자의 발현이 감소하며, PTEN에서도 자궁내막암과 전립선암의 일부에서 메틸화에 의한 PTEN 발현 소실이 보고되었다. 본 연구에서는 침윤성 관암종 조직에서 PTEN 단백에 대한 면역조직화학염색을 통해 PTEN 발현 소실과 임상 및 병리학적 예후인자와의 상관관계를 조사하고, 메틸화에 의한 PTEN 비활성화의 가능성을 메틸화 특이 중합효소연쇄반응을 이용하여 분석하였다. 침윤성 관암종으로 진단되어 유방 절제술을 받은 129예의 여성 유방암을 대상으로 PTEN 단백(monoclnal mouse anti-human PTEN[A2B1], Santa Cruze Biotech, Santa Cruz, USA)에 대한 면역조직화학 염색을 시행하였다. 정상 대조군으로 섬유낭성질환으로 진단받은 유방 조직과 종양 주변에 정상 유선 세포를 사용하였다. PTEN을 발현하는 종양 세포가 전체의 5% 미만인 경우를 음성으로 하였고 PTEN 발현 소실로 판독하였다. 면역조직화학 염색에서 PTEN 발현 소실이 있었던 62예 중 파라핀포매조직의 상태가 양호한 28예에서 메틸화 특이 중합효소연쇄반응을 시행하였다. PTEN 발현 및 메틸화와 임상 및 병리학적 예후인자와의 상관관계를 Mantel-Haenszel Chi-square test로 검정하였다. PTEN 단백에 대한 면역조직화학 염색에서 PTEN 발현 소실이 62예(48%)에서 있었다. 메틸화 특이 중합효소연쇄반응에서 PTEN발현 소실이 있는 28예 중 5예(18%)에서 PTEN 메틸화가 있었다. 림프절 전이가 없는 63예 중 25예(39.7%)에서, 림프절 전이가 있는 66예 중 37예(56.1%)에서 PTEN 발현 소실이 있었으며 림프절 전이가 있는 군에서 PTEN 발현 소실이 의미있게 증가하였다 (p=0.046). 병기 Ⅰ인 29예 중 9예(31.0%)에서, 병기 Ⅱ인 74예 중 35예 (47.3%)예에서, 병기 Ⅲ인 26예 중 18예(69.2%)에서 PTEN 발현 소실이 있었으며 병기가 높을수록 PTEN 발현 소실이 의미있게 증가하였다 (p=0.005) 림프혈관 침윤이 없는 121예 중 55예 (45.5%)에서 림프혈관 침윤이 있는 8예 중 7예(87.5%)에서 PTEN 발현 소실이 있었으며 림프혈관 침윤이 있는 경우 PTEN 발현 소실이 의미있게 증가하였다. (p=0.022). 50세 미만인 82예 중 40예(48.8%)에서, 50세 이상인 47예 중 22예(46.8%)에서 PTEN 발현 소실이 있었으며 환자의 연령군과 PTEN 발현 소실 사이에는 통계학적인 유의성이 없었다(p=0.830). 종양의 크기가 2cm 이하일 때는 50예 중 20예(40.0%)에서, 2cm 초과에서 5cm 이하일 때는 69예 중 35예(50.7%)에서, 5cm 를 초과할 때는 10예 중 7예(70.0%)에서 PTEN 발현 소실이 있었으며 종양의 크기가 증가함에 따라 PTEN 발현 소실이 증가하는 경향을 보였으나 통계학적인 유의성은 없었다.(p=0.072) 핵등급이 저등급인 22예 중 10예(45.5%)에서, 중등급인 73예 중 36예(49.3%)에서, 고등급인 34예 중 16예(47.1%)에서 PTEN 발현 소실이 있었으며 핵등급과 PTEN 발현 소실 사이에는 통계학적인 유의성이 없었다(0.950). 조직학적 등급이 저등급인 25예 중 12예(48.0%)에서, 중등급인 66예 중 29예(44.0%)에서, 고등급인 38예 중 21예(55.3%)에서 PTEN 발현 소실이 있었으며 조직학적 등급과 PTEN 발현 소실 사이에는 통계학적인 유의성이 없었다(p=0.485). 에스트로겐 수용체가 양성인 64예 중 28예(43.8%)에서, 프로게스테론 수용체가 양성인 66예 중 29예(45.0%)에서, c-erbB-2 의 과발현이 있는 24예 중 13예(54.2%)에서, p53이 양성인 29예중 11예(37.9%)에서 PTEN 발현 소실이 있었다. PTEN 발현 소실과 에스트로겐 수용체 양성 (p=0.937), 프로게스테론 수용체 양성(p=0.996), c-erbB-2과발현(p=o.444), p53 양성(p=0.421)사이에는 통계학적인 유의성이 없었다. PTEN 메틸화는 종양의 크기 증가(p=0.048) 및 병기 (p=0.022)와 상관관계가 있었다. 그러나 연령(p=0.972). 림프질 전이(p=0.427), 핵등급(0.848), 조직학적등급(p=0.135), 종양 주변 림프혈관 침윤(p=0.780), 에스트로겐 수용체 양성(p=0.858), 프로게스테론 수용체 양성(p=0.858), c-erbB-2 과발현(p=0.125), p53 양성(p=0.257)사이에는 통계학적 유의성이 없었다. 이상의 결과를 종합하면 PTEN 발현 소실이 침습성 관암종의 48%에서 있으며, PTEN 발현 소실이 있는 증례의 18%에서 PTEN 메틸화를 확인하여 메틸화가 유방암에서 PTEN을 비활성화시킬 수 있는 기전 중 하나가 됨을 확인할 수 있었다. 또한 PTEN 발현 소실이 림프절 전이, 높은 병기, 종양주변 림프혈관 침윤과 상관관계가 있고, PTEN 메틸화가 종양의 크기와 병기가 상관관계가 있어서, PTEN 발현 소실 및 메틸화가 유방암의 진행과 관련있으며, 나쁜 예후 인자로 이용될 수 있음을 시사한다.