Characterization of autophagic cell death mechanism in two different dopaminergic neuronal models

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is a common neurodegenerative disease caused by selective loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta. Current treatments of PD are focused on relief motor problems, but have very limited effectiveness with often serious side effects for long-term usage in PD patients. To overcome the current symptomatic treatments, it is essential to develop neuroprotective drugs that prevent further dopaminergic neuronal cell death in PD. Both apoptosis and autophagy have been implicated in the cell death of dopaminergic neurons in PD. Especially, autophagic cell death has been proposed as an alternative mechanism of dopaminergic neuronal loss in the neurotoxin models, the mutant α-synuclein model and postmortem human brains of PD. In the previous study the occurrence of autophagic cell death was identified in dopaminergic cell death induced by oxidative stress using the wild type dopaminergic neuronal cell line, SN4741. To further investigate molecular mechanism of autophagic cell death, two different models of autophagic cell death were developed and characterized. First, the genetic model was produced by using caspase 3 null mutations. The caspase 3-deficient cell model demonstrated no apoptotic cell death under oxidative stress, but demonstrated a very significant cell death by rapamycin treatment. The rapamycin-induced dopaminergic neuronal cell death was accompanied by the increased levels of autophagic markers without activation of caspase 3 in the caspase 3-deficient genetic model, a typical feature of autophagic cell death. Second, the chemical model, induced by high dose rapamycin demonstrated over 50% cell death within 24 hr in the wild type SN4741 cells. The cell death accompanied with the accumulation of autophagosomes, suppression of mTOR and S6K activity without noticeable activation of caspase 3, suggesting the involvement of autophagic cell death. Third, the treatment of 3-MA, the autophagy inhibitor, could enhance the cellular viability against to rapamycin-induced cell death, but the apoptosis inhibitor, z-VAD, did not prevent cell death. Finally, the DJ-1- or PINK1-deficient dopaminergic cells, the cellular models for the familial PD, demonstrated the increased autophagic cell death than the wild type SN4741 cells by the same dose rapamycin treatment. This result demonstrates two different autophagic cell death models without apoptotic feature. Therefore, further characterization of these models will help elucidate molecular basis underlying autophagic cell death in dopaminergic neurons.;파킨슨씨병은 중뇌 흑질의 도파민 신경이 선택적으로 손실되어 나타나는 대표적인 신경 퇴행성 질환이다. 현재의 치료법들이 파킨슨씨병 환자들의 운동장애를 경감하기 위하여 실행되고 있으나 장기 사용시 심각한 부작용이 나타나는 등 사용에 제약이 있다. 이런 대증요법의 한계를 극복하기 위하여 파킨슨씨병에서 나타나는 도파민 신경 세포 사멸의 진행을 막는 신경보호 약물의 개발이 필요하다. 파킨슨씨 병에서 일어나는 도파민 신경 손실의 기전에는 apoptosis와 autophagy가 관련되어 있다고 알려져있다. 특히 autophagic cell death는 신경독소 모델, α-synuclein 돌연변이 모델, 파킨슨씨병 환자 사후 신경 모델에서 도파민 신경세포 손실의 또다른 기전으로 제시되고 있다. 이전의 연구에서 도파민 신경세포 모델인 SN4741에서 산화 스트레스 (oxidative stress)에 의해 유발되는 도파민 신경의 세포사멸에 autophagic cell death가 확인되었다. 본 연구실에서는 autophagic cell death 기전에 대해 알아보기 위하여 autophagic cell death의 두가지의 모델을 개발하고 연구하였다. 먼저, caspase 3 유전자 삭제를 통하여 만든 유전모델인 caspase 3 결핍 세포는 산화 스트레스에서는apoptotic cell death가 관찰되지 않았으나 rapamycin 처리에서는 상당한 세포사멸이 일어났다. Caspase 3 결핍세포에서 관찰된 rapamycin에 의한 도파민 신경세포의 사멸에서는 caspase 3의 활성은 일어나지 않으나 autophagy의 특징은 증가하는 autophagic cell death의 현상이 나타났다. 두번째로 고농도의 rapamycin으로 신경세포의 사멸을 유도하는 화학모델에서는 SN4741에서 24 시간내로 50% 이상의 세포사멸을 유도하였다. 이 모델에서의 세포 사멸에서는 뚜렷한 caspase 3의 활성 없이 autophagosome의 축적, mTOR와 S6K의 활성 억제가 나타나는 autophagic cell death의 현상이 관찰되었다. 세번째로 autophagy의 억제제인 3-MA처리시에는 rapamycin 유도 사멸에서 세포생존이 증가하였으나 apoptosis 억제제인 z-VAD의 처리시에는 세포사멸을 막지 못하였다. 마지막으로 가족성 유전성 파킨슨씨병의 세포모델인 DJ-1과 PINK1 결핍세포에서는 같은 농도의 rapamycin을 처리했을 때SN4741보다 autophagic cell death가 증가하였다. 그러므로 이 두 모델에 대한 연구는 도파민 신경에서 나타나는 autophagic cell death에 대한 이해를 높이는데 기여할 수 있을 것이다.