Studies on Oxidative Regulation of Nm23, Tumor Metastasis Suppressor Protein

Abstract

Nm23, tumor metastasis suppressor, is a multifunctional protein involved in enzymatic activity of nucleoside diphosphate kinase (NDPK) as a house keeping enzyme and the regulation of biological activities such as development, differentiation, proliferation, endocytosis, and apoptosis. However, the regulatory mechanism of Nm23 remained unclear. Our previous studies showed that oxido reduction of Nm23-H1 regulates its enzymatic activity by conformational change of the quaternary structure. Also we identified the interacting proteins and modifications of Nm23-H1 in response to oxidative stress including sulfonic acid, intra- and inter-disulfide crosslinks, and glutathionylation both in vivo and in vitro. Oxidized Nm23-H1 loses its ability to suppress tumor metastasis as well as enzymatic activity. Also oxidized Nm23-H1 interacts with thioredoxin reductase (TrxR) and is reduced through NADPH-TrxR-Trx system. In this study, I tried to explain the molecular mechanism of Nm23-H1 regulation by oxido-reduction employing various cysteine mutants, C4S, C109A and C145S. Enzyme activity and disulfide formation of Nm23-H1 and its cysteine mutants were examined in response to oxidative stress. Nm23-H1 turns out to be easily oxidized to form intra-disulfide crosslink between Cys4 and Cys145, and then Cys109 was exposed to surface area and easily oxidized. In this process, native hexameric structure of Nm23-H1 was dissociated to dimeric form and Nm23-H1 lost its enzymatic activity. These results suggest that cysteine residues of Nm23-H1 play a crucial role in regulating its enzymatic activity. To investigate whether Nm23-H1 plays a role to regulate cellular ROS level, intracellular ROS level in response to oxidative stress was measured in cells overexpressing Nm23-H1 and its mutants. ROS level of cells overexpressing Nm23-H1 and its C109A mutant were lower than control cells in response to H2O2 treatment. These results suggest that Nm23-H1 plays a key role in tumor metastasis by regulating cellular ROS level and its enzymatic activity by using oxido-reduction shuttle system.;암 전이 억제 단백질로 알려진 Nm23-H1은 세포 내에서 뉴클레오시드3인산의 말단 인산기를 뉴클레오시드2인산으로 이동시켜 주는 효소의 기능을 가지고 있고, 그 밖에 세포 발달, 분화, 생장, 사멸에 관련하여 다양한 기능을 가진다. Nm23-H1이 암 전이를 억제하고 세포 내 활성 산소의 양 조절에 어떠한 역할을 하고 있다고 보고되고는 있지만 그 조절 기전에 대해서는 아직 자세히 밝혀져 있지 않다. 이전 연구에서 우리는 Nm23-H1의 Cys109 잔기가 산화적 스트레스에 의해 다양한 modification을 만들고 이것이 Nm23-H1의 효소 활성과 암 전이 억제 능력을 조절한다는 것을 알게 되었다. 또한 Nm23-H1의 활성은 NADPH-TrxR-Trx system에 의해 산화·환원 됨으로써 조절된다. 이를 바탕으로 Nm23-H1의 조절 기전을 찾기 위해 산화적 스트레스에 의한 Nm23-H1의 분자적 변화를 확인하였다. Nm23-H1이 산화되면 Cys4와 Cys145 잔기 사이에 disulfide 결합이 형성되고, C-terminal 쪽에서 커다란 구조적 변화가 일어나 Cys109 잔기가 밖으로 노출되면서 쉽게 산화될 수 있다. 이 구조적 변화는 Nm23-H1을 육합체에서 이합체로 분리 시켜 단백질의 활성을 잃게 만든다. 이 같은 결과는 Nm23-H1의 시스테인 잔기들이 산화적 스트레스의 반응에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 또한 Nm23-H1이 ROS 신호전달 과정에서 중요한 역할을 한다는 이전 연구 결과를 바탕으로 Nm23-H1가 세포 내 활성 산소의 양을 조절하는지를 확인하는 실험을 수행하였다. Nm23-H1이 과발현 되었을 때 산화적 스트레스에 의한 활성 산소의 증가가 줄어든다는 것을 확인하였고, Cys109 잔기가 변이되면 산화적 스트레스에 더욱 저항성을 가지는 것을 확인하였다. 이처럼 Nm23-H1이 산화·환원에 의해 자신의 생물학적 활성을 조절하고 세포 내 활성 산소의 양을 조절한다는 본 연구 결과를 통하여, 암 전이 억제 단백질로서의 Nm23-H1의 작용 기전을 설명할 수 있을 것이다.