The function of Ahnak protein in PDGF-mediated cell proliferation and migration

Abstract

Neuroblastoma 세포와 피부 상피 세포에서 클로닝된 Ahnak이란 단백질은 비정상적으로 크기 (700 kDa)가 커서 유대어로 “거인 (giant)”이라는 의미를 갖는 Ahnak으로 명명되었다. 이 같은 Ahnak은 구조적으로 3개의 부분으로 구분되는데, NH2-말단은 251개 아미노산으로 구성되며, COOH-말단은 1002개 아미노산으로 구성되어 있다. 이들 NH2-말단과 COOH-말단 사이에 4300개 아미노산으로 구성된 중앙부분은 128개 아미노산이 36번 반복되는 비정상적인 구조를 가지고 있으며 각각의 중앙 반복구조는 80% 동일성이 있다. Ahnak의 중앙반복구조 (central repeated unit, CRU)는 (D/E)ΦΩΦK(A/G)P (Φ: 소수성 아미노산, Ω: 친수성 아미노산)으로 구성된 hepta-amino acid 서열을 가지고 있으며, 이들은 긴 β-strand 구조를 가진 폴리이온성 아미노산과 소수성 아미노산이 각기 다른 면에 있는 독특한 구조를 이루고 있다. Ahnak의 COOH-말단 영역은 L-type 칼슘 채널 또는 S100B 단백질과 결합해서 칼슘의 항상성 유지에 기여하며, annexin 2/S100A10과 결합체를 이루어서 cytoskeleton의 토대를 이루는 역할을 한다. 특히, NIH3T3 fibroblast, MDCK cells, 그리고 HeLa cells과 같은 여러 종류 세포에서 Ahnak은 주로 핵에 존재하며 세포질에는 소량 존재하지만, PKC와 고농도 칼슘 유입에 의하여 세포막으로 이동하는 것이 알려져 있다. 그리고 PKB에 의하여 Ahnak의 COOH-말단 영역의 Ser 5535가 인산화되면 핵에서 세포질로 이동하는 것이 보고되었다. 이처럼 Ahnak은 독특한 구조로 인해 세포 신호전달에 있어서 scaffolding 단백질의 역할을 할 것이라고 여겨졌지만, 그 생물학적 특징은 아직 자세하게 밝혀지지 않았다. 그래서 파트 I 에서는 PDGF에 의한 세포 성장에 있어서, Ahnak의 역할을 설명하고자 한다. 이전에 우리는 Ahnak이 세포 신호전달 과정에서 매우 중요한 막 인지질을 분해하는 효소인 phospholipase C-γ의 activator라는 것을 보여주었다. 또한 Ahnak의 중앙반복구조 (4CRUs)는 세포 성장을 조절하는 세포 내 신호전달 과정에서 PMA나 bradykinin과 같은 mitogenic signal에 반응해서 PLCγ, PKCα와 결합하고 이들을 활성화시키며, PLCγ, PKC, PLA2를 이어주는 scaffolding 단백질로 작용하는 것을 밝혔다. 그리고 GST pull down assay와 immunoprecipitation 실험을 통해, Ahnak의 중앙반복구조가 PKCα, βII, δ 그리고 ζ와 결합하고 있음을 보았고, PS/DG와 상관없이 PKCα를 활성화시키는 것도 알 수 있었다. Ahnak의 중앙반복구조가 과발현된 NIH3T3 cells에 PMA를 처리했을 때에는, Raf/MEK/Erk와 같은 PKC의 조절을 받는 하위 단계의 반응이 단계적으로 활성화 되는 것을 볼 수 있었다. 우리는 Ahnak의 세포 내 분자적 기능을 정확하게 이해하고 조절할 수 있는 연구를 수행하기 위해 Ahnak knockout mouse를 만들어 MEF (Mouse embryonic fibroblasts) cell system을 확립하였다. Ahnak knockout MEF cell에 PMA 자극을 주었을 때, wild type MEF cell과 비교하여 PKC의 인산화가 감소하는 것을 보았고, PKC의 활성화에 조절받는 Raf/MEK/Erk의 인산화 역시 감소하는 것을 확인하였다. 그리고 PMA를 처리했을 때, Erk에 의해 인산화되고 활성화 된다고 알려진 전사인자인 Elk-1의 transcriptional activity가 Ahnak이 있는 wild type MEF cell에서 증가하는 것을 보았다. 다음으로, 독특한 구조로 인해 중요한 역할을 할 것이라고 생각되는 Ahnak의 중앙반복구조를 Ahnak knockout MEF cell에 add-back 했을 때, PKC의 인산화가 다시 증가하는 것을 보았다. 이것은 Ahnak의 중앙반복구조가 전체 Ahnak 단백질의 역할을 대변한다고 볼 수 있다. 또한, PKC의 physiological activator인 PDGF자극에 의해 wild type MEF cell에서 PKCα가 plasma membrane으로 이동하는 것을 보았다. 더 나아가, PDGF에 의해 Ahnak knockout MEF cell에서 Raf/MEK/Erk의 인산화가 감소하고, Ahnak의 중앙반복구조의 add-back을 통해, 이러한 현상이 회복되는 것을 확인하였다. 마지막으로, immunoprecipitation 실험을 통해, Ahnak이 있을 때에는 PKC와 인산분해효소인 PP2A가 complex를 이루고 있다가, PMA 자극에 의해 이 결합이 분리되고, Ahnak knockout MEF cell에서는 이러한 현상이 나타나지 않는 것을 볼 수 있었다. 이러한 결과들을 종합하여, 우리는 PKC와 PP2A complex의 분리현상을 통해 Ahnak이 PP2A를 조절함으로써 PKC를 활성화시키고, 이어서 c-Raf/MEK/Erk pathway를 활성화시킨다는 것을 알았다. 파트 II 에서는 PDGF에 의한 세포 이동에 있어서 Ahnak의 효과를 설명하고자 한다. 우리는 파트 I 에서 Ahnak이 PKC를 통해 c-Raf/MEK/Erk pathway를 활성화 시킨다는 것을 알았다. 이미 보고된 연구 결과에 의하면, 혈관 내 세포 이동을 촉진하는 혈관 손상에 의해 MAPK (mitogen-activated protein kinase) pathway가 활성화 된다고 한다. Ahnak은 대동맥 평활근 세포에 많이 발현되어 있지만, 아직 혈관계에서의 생물학적 기능은 밝혀진 바 없다. 그래서 우리는 wild type과 Ahnak knockout mice의 대동맥에서 평활근 세포를 분리하여, 세포 이동에서 Ahnak의 역할을 조사하였다. Transwell migration assay와 wound healing assay 결과, PDGF 자극에 의해 wild type 대동맥 평활근 세포의 이동이 Ahnak knockout 대동맥 평활근 세포에 비해 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 게다가 wild type 평활근 세포에 PDGF 자극을 주었을 때, Ahnak knockout 평활근 세포와 비교하여 PKC, Erk의 인산화가 증가하는 것을 보았다. 또한 활성화된 Rac에 의한 lamellipodial protrusion과 이동하는 세포의 표면에 형성되는 ruffle이 PDGF 자극을 주었을 때, wild type 평활근 세포에서 많이 발생하는 것을 보았다. 평활근 세포 이동은 혈관성형술 (angioplasty) 이후, 죽상동맥경화증(atherosclerosis)과 재협착 (restenosis)의 진행에 있어서 중요한 현상이다. 그러므로 wild type과 Ahnak knockout mouse의 목 동맥 묶음술 (ligation injury)을 통해 그 과정에서 Ahnak의 역할을 알아보았다. 그 결과, Ahnak knockout mouse의 목 동맥에서 신생혈관내막의 형성과 평활근의 이동이 wild type mouse에 비해 현저하게 지체되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과들을 종합하여, Ahnak은 Erk cascade와 Rac 단백질의 활성을 통해 대동맥 평활근 세포 이동에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 알았다.;Ahnak is a protein of an exceptionally large size (700kDa) and contains 36 central repeated units (CRUs). Each repeated unit has at least 80% identity to others. Because of this unique structure, Ahnak protein has been proposed to be a scaffolding protein in cell signaling, its biochemical properties have not yet been defined in detail. In Part I, the mechanism of Ahnak in PDGF-mediated cell proliferation will be described. We have previously reported that central repeated units (CRUs) of Ahnak act as a scaffolding protein networking PLC-γ and PKCα. Moreover, we demonstrated that four central repeated units of Ahnak protein bind and activate PKCα in a PS/DG-independent manner. To evaluate the effect of loss-of-function of Ahnak in cell signaling, we investigated PKC activation and Raf phosphorylation in embryonic fibroblast cells (MEF) of Ahnak knockout mice. Wild type MEF cells showed enhanced c-Raf, MEK, and Erk phosphorylation in response to PMA, compared to Ahnak knockout MEF cells. Furthermore, membrane translocation of PKCα and phosphorylation of Raf in response to PMA or PDGF were decreased in Ahnak knockout MEF cells compared to wild type MEF cells. Several lines of evidence suggest that PKCα activity is regulated through association with phosphatase 2A (PP2A). Co-immunoprecipitation assay indicated that the association of PKCα with PP2A was broken off in wild type MEF cells in response to PMA. Consistently, Ahnak knockout MEF cells stimulated by PMA showed enhanced PKC-PP2A complex formation, and add-back expression of Ahnak into Ahnak knockout MEF cells abolished the PKC-PP2A complex formation in response to PMA. These data indicate that Ahnak potentiates PKC activation through inhibiting the interaction of PKC with PP2A. In Part II, the effect of Ahnak in PDGF-mediated cell migration will be described. In Part I, we showed that Ahnak potentiated PKC-dependent c-Raf/MEK/Erk cascade. Several lines of evidence indicate that mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is known to be activated by vascular injury which, in turn, promotes vascular cell migration. Although the Ahnak protein is highly expressed in aortic SMCs, its detailed biological function in vasculature is unknown. In this study, primary aortic SMCs were prepared from wild type and Ahnak knockout mice, we investigated that the role of Ahnak in the migration of aortic smooth muscle cells (ASMC). Migration of wild type aortic SMCs was significantly increased by platelet-derived growth factor (PDGF) stimulation in transwell chamber and wound healing assays, whereas aortic SMCs from Ahnak knockout mice failed to migrate. In addition, Ahnak proteins showed an enhanced PKC and Erk phosphorylation in wild type aortic SMCs, whereas Ahnak knockout aortic SMCs failed to activate the cell signaling cascade. Stimulation of wild type aortic SMCs with PDGF resulted in Rac activation-mediated lamellipodial protrusion and membrane ruffling in migrating cells. However, Ahnak knockout aortic SMCs displayed lower activation of Rac in response to PDGF which resulted in slow lamellipodial protrusion rate and cell migration. Aortic SMC migration is a key event in the lesion progression of atherosclerosis and restenosis after angioplasty. The role of Ahnak in this process was examined using an in vivo model in which carotid artery of mice are subjected to post ligation injury. We demonstrate that neointimal formation and SMC migration after ligation injury in Ahnak knockout mice were significantly retarded in carotid artery compared to wild type mice. Taken together, Ahnak protein plays an important role in aortic SMC migration through activation of Erk cascade and Rac protein.