Dextran sulfate sodium 유발 마우스 장염 모델에서 5-lipoxygenase 억제제인 B-98의 효과

Abstract

목적: 염증성 장질환의 염증반응에 많은 염증매개물질들이 관련이 있는데, 이 중에서 leukotriene은 강력한 염증 매개체로, 염증성 장질환의 병태생리에 주요 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Leukotriene은 5-lipoxygenase (5-LO)에 의해 arachidonic acid에서 생성되며, leukotriene의 생성을 억제하는 5-LO 억제제가 염증성 장질환의 치료제로 기대되어 왔다. 최근 새로운 5-LO 억제제로 benzothiazole 유도체인 B-98 (5-Chloro-N-(4-ethylphenyl)benzo[d] oxazol-2-amine)을 천식용 동물 모델에 투여했을 때, 조직학적인 호전 및 천식의 염증반응에서 중요한 역할을 하는 IL-4, IL-5, IL-13의 합성이 감소하였다. 본 연구는 새로운 5-LO 억제제인 B-98을 장염 마우스 모델에 투여하여 임상 양상 및 조직학적 변화를 확인하고, 관련 사이토카인인 IL-6, TNF-α와 CD4+ T세포 분획의 변화를 측정하여 B-98의 치료효과를 알아보고자 하였다. 방법: C57BL/6 마우스를 정상 대조군, dextran sulfate sodium (DSS) 장염군, B-98 저용량 투여군(20 mg/kg), B-98 고용량 투여군(100 mg/kg)으로 나누고 7일간 3% DSS을 복용시켜 장염을 유발하였으며, B-98은 하루에 한번씩 복강 내로 주사하였다. 육안적 장염의 평가는 Disease Activity Index (DAI)를 이용하였으며, 조직학적인 분석은 Histologic colitis scoring system을 따랐으며 대장 조직의, IL-6, TNF-α를 측정하였으며, 소장 고유층 세포의 분리하여 CD4+ T세포의 유세포 분석하였다. 결과: 장염유도 4일째에 모든 마우스들이 급성 장염 증상을 보였고 투약 7일째에는 B-98을 투여한 군에서 DSS 장염군에 비해 DAI가 낮은 경향을 보였다. 정상 대조군의 평균 대장 길이가 82.5 mm임에 비하여 DSS 장염군은 49.5 mm로 유의하게 짧았고(p <0.01), B-98 투여군은 DSS 장염군에 비하여 장 길이가 더 긴 경향을 보였으나, 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 조직학적 점수체계(Histologic scoring system)를 적용하였을 때 B-98 저용량 투여군이 DSS 장염군에 비하여 유의하게 낮은 점수를 보였다(p<0.05). DSS 장염군에서 정상 대조군에 비하여 IL-6 수치가 유의하게 증가했으며(p<0.05), B-98 저용량 투여군과 고용량 투여군에서 모두 IL-6수치가 유의하게 감소하였다(p<0.05). DSS 장염군에서 IFN-γ+ Th1 세포, IL-9+ Th9 세포, IL-17+ Th17 세포의 분획이 유의하게 증가하였고 B-98 저용량 투여군에서 모두 유의하게 감소하였다(p<0.05). IL-4+ Th2 세포와 Foxp3+ Treg 세포는 B-98 투여군에서 유의한 변화를 보이지 않았다 결론: DSS를 이용한 장염 모델에서 새로운 5-LO 억제제인 B-98를 이용하여 장염의 염증 소견이 호전되고 IL-6가 감소한 것을 확인함으로써 장염 모델에서 B-98의 치료 효과가 있음을 제시하였다. 또한 DSS 장염 모델에서 CD4+ Th1, Th9, Th17 세포가 관여하는 것으로 나타났으며, B-98을 투여시 증가했던 Th1, Th9, Th17 세포발현이 감소하여 약제의 치료 효과가 Th1, Th9, Th17 세포의 면역작용과 관련이 있는 것으로 생각된다.;Background/Aims: Amplification of mucosal inflammatory response in inflammatory bowel disease is likely to be controlled by a number of soluble mediators. These include prostaglandins, leukotrienes, histamine, serotonin, and complement pathway products. The unique role of enzyme 5-lipoxygenase (5-LO) in the production of leukotrienes makes it a therapeutic target for inflammatory bowel disease (IBD). It is thought that imbalances in the helper T cell (Th cell) subsets and dysfunction of regulatory T cells (Treg cells) contribute to IBD. The aim of this study was to evaluate the effects of B-98, a newly synthesized benzoxazole derivative and a novel 5-lipoxygenase inhibitor, in a mouse model of IBD induced by dextran sulfate sodium (DSS). We also investigated the effect of B-98 on the Th cell and Treg cell profiles in this animal model. Methods: Seven to eight weeks old C57BL/6 mice were randomly assigned to four groups: normal control, DSS colitis (DSS + saline), low dose B-98 (DSS + B-98 20mg/kg) and high dose B-98 (DSS + B-98 100 mg/kg). For the induction of acute colitis, the mice were treated with 3% DSS for seven days. B-98 diluted in dimethyl sulfoxide was administered simultaneously with DSS from day 1 to 7 through an intraperitoneal route. On day 8, the mice were sacrificed and proximal and distal colonic specimens were obtained. The severity of the colitis was assessed via the disease activity index (DAI), colon length, and histopathologic grading. The production of cytokines IL-6 and TNF-α was determined by RT-PCR. Th cells from the lamina propia were examined for the expression of IFN-γ (Th1 cell), IL-4 (Th2 cell), IL-9 (Th9 cell), IL-17 (Th17 cell) and Foxp3 (Treg cell) using intracellular cytometry. Results: The mice in the DSS colitis group suffered hematochezia from day 4 and showed marked colonic shortening compared with the normal control group (82.5 vs 49.5 mm, p<0.01). The B-98 group showed lower DAI, less shortening of the colon length and lower histopathologic grading (p<0.01) compared with the DSS colitis group. The expression of anti-inflammatory cytokine IL-6 in colonic tissue was significantly lower in the B-98 groups than in the DSS colitis group (p<0.05). However, there were no significant differences in the TNF-α levels between the groups. The cellular profiles revealed that the Th1, Th9 and Th17 cells were elevated in the DSS colitis group and decreased in the B-98 group (p<0.05). No significant differences were found in the Th2 or Treg cells between the groups. Conclusions: Our results suggest that the B-98 ameliorated intestinal inflammation and reduced the IL-6 levels. B-98 may be involved with Th1, Th9 and Th17 cellular immunity in acute colitis model. Further evaluations would be needed to elucidate the exact effects of B-98.