고세균의 DNA polymerase Vent와 Dpo4의 손상 DNA에 대한 translesion DNA 합성

Abstract

Cellular DNA is continuously attacked by physical agents and by various endogenous or exogenous chemicals, which can produce DNA damage, including abasic sites, alkyl lesions, UV-induced pyrimidine dimers. Even with all of the cellular DNA repair systems available, some DNA adducts are present in cells and can lead to misincorporation, mutation, and blockage when they interact with DNA polymerases, potentially causing cell death, aging, and cancer. DNA base guanines are susceptible at N² and O⁶ positions to modification by various potential carcinogens including formaldehyde, acetaldehyde, benzo[a]pyrene, and alkylating agents. Abasic (apurinic/apyrimidinic : AP) sites are most frequently formed cellular DNA lesions, which can induce mutation and replicative blockage. Vent DNA polymerase, a B-family DNA polymerase from the hyperthermophilc archaea, Thermococcu litoralis, is a major replicative DNA polymerase. Vent DNA polymerase can be utilized as a model B-family DNA polymerase, which can be blocked at various DNA lesions during DNA replication. DNA polymerase IV (Dpo4), a Y-family DNA polymerase from the thermophilic archaea Sulfolobus solfataricus, is one of the so-called translesion synthesis DNA polymerases. Dpo4 has been studied as a model Y-family polymerase and reported to be involved in replicative bypass across various DNA lesions. To better understand the effects of modified DNA on DNA binding and lesion bypass by Vent and Dpo4, purified polymerase was studied with three series of DNA lesions, N²-G (N2-methyl (Me)G, N2-benzyl (Bz)G, N2-(CH3)anthracenyl (Anth)G), O6-G (O6-methy (Me)G, O6-benzyl (Bz)G) adducts and AP site. Vent readily copied past N²-MeG and O⁶-MeG but were severly blocked at N²-BzG and O⁶-BzG. In contrast, Dpo4 readily copied past N²-MeG, O⁶-MeG, and N²-BzG and bypassed O⁶-BzG, N²-(CH3)anthracenyl (Anth)G to some extent. Interestingly both Dpo4 and Vent bypassed AP site relatively well. Steady-state kinetic parameters (kcat/Km) for dCTP incorporation by Dpo4 were severely cabout 300-fold reduced opposite O6-MeG and O6-BzG adducts, but not much opposite N²-MeG and N²-BzG adducts, compared to G. In contrast, Vent showed the marked (about 500-fold) decrease in kcat/Km (catalytic efficiency) for dCTP incorporation similarly opposite both N²-MeG and O6-MeG, compared to G. Dpo4 showed a strong preference for correct dCTP opposite N²-G adducts, O6-G adducts and AP site. In contrast, Vent showed a strong preference for dGTP (misinsertion frequency f = 3) opposite N²-MeG and dTTP (f = 2) opposite O⁶-MeG. Dpo4 and Vent mostly bound the adducted DNA , when compared to with the slightly or increased (up to 1.6-fold) similar affinity unmodified DNA. Interestingly, Vent bound N²-AnthG-adducted DNA about 4-fold more tightly than unmodified DNA. In conclusion, our results suggest that Dpo4 is much more catalytically efficient and accurate in nucleotide insertion opposite N2- and O6-G adducts than Vent, although having similar binding affinities to normal and adducted DNA substrates. In contrast, Dpo4 and Vent were similarly efficient in nucleotide insertion opposite AP site, but with different processivity and dNTP selectivity. And DNA polymerization by Dpo4 is much more efficient at N2-G adducts than O6-G adducts, whereas DNA polymerization by Vent is not much different at both N2-G and O6-G adducts.;세포내의 DNA는 염기의 alkylation, 자외선으로 인한 thymidine dimer 형성, 화학물질로 인한 DNA adduct 형성, abasic site 생성 등의 세포내의 내적인 요인과 외적인 요인으로 인해 끊임없이 손상 받는다. 세포내에서 손상된 DNA는 수복 과정을 통해 정상 DNA로 복구되기도 하지만 손상된 DNA가 세포내에 잔존하게 되면 DNA polymerase에의한 잘못된 염기삽입 (misincorporation)과 돌연변이를 유발하거나 DNA 복제를 중지시킴으로서 세포사멸 (cell death), 노화 및 종양을 유발하는 원인으로 작용하게 된다. DNA의 염기 중 G의 N²와 O6부분은 formaldehyde, acetaldehyde, benzo[a]pyrene, alkylating agents를 비롯한 다양한 화학물질 등에 노출되어 손상받기 쉽다. 또한 abasic (apurinic/apyrimidinic : AP) site는 세포 내에서 가장 많이 형성되는 손상물로 돌연변이를 유발하거나 DNA 복제를 중지시키는 손상물이다. Vent DNA polymerase는 hyperthermophilc archaea에 속하는 Thermococcus litoralis의 B-family DNA polymerase로서 복제과정에서 주된 역할을 하는 DNA polymerase이다. Vent는 DNA 복제를 진행하는 과정에서 손상된 DNA와 직면하게 될 경우 복제진행을 멈춘다. DNA polymerase Ⅵ (Dpo4)는 thermophilic archaea에 속하는 Sulfolobus solfataricus로부터 유래한 Y-family DNA polymerase로서 translesion synthesis (TLS) DNA polymerase 중의 하나이다. Dpo4는 손상된 DNA와 직면할 때 손상된 부위에서 DNA 합성을 진행할 수 있다. 본 연구에서는 replicative DNA polymerase Vent와 translesion synthesis DNA polymerase Dpo4의 손상 DNA에 대한 결합 및 translesion DNA 합성을 연구하였다. 손상 DNA는 N²-G (N²-methyl (Me)G, N²-benzyl (N²-Bz)G, N²-(CH3)anthracenyl (Anth)G) 및 O6-G (O⁶-methyl (Me)G, O⁶-benzyl (N²-Bz) G) adduct, AP site 3그룹으로 나누어 실험을 행하였다. Vent는 N²-MeG 및 O⁶-MeG에 대해 효과적으로 DNA를 합성하였지만 N²-BzG, N²-AnthG 그리고 O⁶-BzG에 대해서는 합성이 거의 이루어지지 않았다. 반면 Dpo4는 N²-MeG및 O⁶-MeG 그리고 N²-BzG에 대해 DNA 합성을 잘하였고 O⁶-BzG과 N²-AnthG에 대해서도 일부 extension되어 DNA 손상물을 통과(bypass)하여 DNA 합성을 하였다. 흥미롭게도 AP site의 경우는 Dpo4와 Vent가 비슷한 정도로 합성하였다. Dpo4에 의한 dCTP 삽입 시 steady-state kinetic parameters에 대하여 정상 G과 손상 G의 경우를 비교했을 시, N²-G adduct에 대한 kcat/Km (catalytic efficiency)은 정상G의 경우와 비슷하거나 10배정도 저하를 보여 약 300배 감소를 보인 O6-G adduct보다 훨씬 kcat/Km이 높게 유지되었다. 이에 비하여 Vent는 정상 G에 비해 N²-MeG와 O6-MeG의 경우 모두 dCTP삽입 시 kcat/Km이 대략 500배의 감소를 보였다. Dpo4는 단일 dNTP의 삽입선택성에 있어 N²-G adduct, O6-G adduct, AP site에 대해 dCTP를 잘 삽입하였다. 이에 반해 Vent는 N²-MeG에 대해 dGTP (misinsertion efficiency f = 3), O⁶-MeG에 대해 dTTP (f = 2) 삽입을 선호하였다. DNA에 대한 결합 친화력(binding affinity)에 있어서 Dpo4와 Vent는 정상 G에 비교할때 손상 DNA에 대하여 비슷하거나 약간 (1.6배) 증가함을 보였다. 그러나 흥미롭게도 Vent의 N²-(CH3)anthracenylG adduct의 경우 정상 DNA보다 대략 4배정도 현저히 높은binding affinity를 보였다. 결론적으로 본 연구에서 Dpo4는 Vent보다 N²-G 및 O6-G adducts들에 대해 dNTP를 삽입했을 시 catalytic efficiency와 정확성이 훨씬 높았으나 Dpo4와 Vent의 정상 DNA와 손상 DNA에 대한 DNA bindnig affinity는 크게 다르지 않았다. AP site의 경우 Dpo4와 Vent는 비슷한 dNTP 삽입효율을 보였으나 dNTP를 삽입선택성은 상이하였다. 그리고 Dpo4에 의한 DNA 중합반응은 N²-G adduct에 대하여 O6-G adduct보다 훨씬 효과적 이었으며, 이에 반해 Vent의 DNA 중합반응은 N²-G adduct와 O6-G adduct의 경우 큰 차이가 없었다.