Mesenchymal stromal cells inhibit graft versus host disease of mice by inducing Foxp3+ regulatory T cells

Abstract

연구배경 이식편대 숙주 병은 동종 조혈모세포 이식 후 발생하는 주요한 합병증의 하나이다. 최근 연구결과 치료 불응성 이식편대 숙주 병의 치료에 인간 중간엽줄기세포의 효과가 증명되고 있지만, 중간엽 줄기세포의 인체 내 생존 및 분포, 최적의 세포 용량 등은 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 이식편대 숙주 병의 동물 모델을 만들어 중간엽 줄기세포의 효과와 그 억제 기전을 연구하고자 하였다. 실험방법 C3H/he 또는 C57BL/6 마우스의 골수세포와 C3H/he 또는 C57BL/6 EGFP 마우스의 비장세포를 얻은 뒤, 치사량의 방사선을 조사한 BALB/c 마우스에 투여하여 이식편대 숙주 병 모델을 만들었다. 중간엽 줄기세포는 C3H/he 마우스 혹은 C3H/10T1/2 마우스 중간엽 줄기세포주 혹은 C57BL/6 RFP 마우스로부터 얻었다. 투여한 비장세포 (EGFP) 와 중간엽 줄기세포 (RFP)의 생체 내 움직임은 IVIS-Xenogen system으로 형광 값을 측정하였다. 이식편대 숙주 병의 발생과 치료효과는 임상적, 조직학적 점수로 비교하였고, 조절 T 림프구에 특이적으로 발현하는 전사인자인 Foxp3의 발현을 측정하였다. 실험결과 투여한 비장세포와 중간엽 줄기세포는 먼저 폐, 위장관, 림프절 순서로 이동하였고, 이 세포들의 이동 시간 및 생체 내 위치는 매우 비슷한 경로였다. C3H10T1/2 세포 투여 후 림프절 내 Foxp3 mRNA 발현은 실시간 PCR로 측정한 결과 유의하게 증가되었다. 혼합 림프구 배양법을 이용하여 최적의 비장세포 증식 억제 세포 용량을 결정하였다 (중간엽 줄기세포: 비장 세포 = 1:2 과 1:1). 비장세포의 용량을 고정하고 (1 × 10^(6)), C3H10T1/2 세포 용량을 세 종류 (저용량, 0.5 × 10^(6) 중간용량, 1 × 10^(6) 고용량 2 × 10^(6)) 로 나누어 이식편대 숙주병 모델에 투여 후 치료 효과를 비교하였다. 임상적, 조직학적 점수와 Kaplan-Meier 생존율로 비교해 본 결과 중간엽 줄기세포 투여 후 용량 의존적으로 이식편대 숙주 병을 억제시켰다. 결론 중간엽 줄기세포는 이식편대 숙주 병을 용량 의존적으로 억제하였고, 여기에는 Foxp3+ 조절 T 림프구의 증식이 관여하였다. 본 마우스 모델은 이식편대 숙주 병에서 중간엽 줄기세포의 효과를 연구하는데 적합하였다.;Background Graft-versus-host disease (GVHD) remains a major complication after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Recent literature demonstrates a potential benefit of human mesenchymal stromal cells (MSC) for the prevention of refractory GVHD. However, their cellular fate, distribution and optimal dose remain uncertain. I set out to develop an animal model that can be used to study the effect of MSCs on GVHD. Methods A GVHD mouse model was established by transplanting C3H/he or C57BL/6 donor bone marrow cells (BMC) and C3H/he or C57BL/6-EGFP spleen cells (SP) into lethally irradiated BALB/c recipient mice. MSCs were obtained from C3H/he mice or C57BL/6-RFP mice as well as C3H/10T1/2 (murine MSC). Three different C3H10T1/2 cell doses (low, 0.5 × 10^(6); intermediate, 1 × 10^(6); high 2 × 10^(6)) with consistent SP dose (1 × 10^(6)) were evaluated for their therapeutic potential in an in vivo GVHD model. In vivo movement of donor SP (EGFP) and MSC (RFP) were evaluated by measuring of biofluorescence (IVIS-Xenogen system). GVHD and disease progression were evaluated by clinical and histological scoring. Percentage of Foxp3+ was measured by flviiow cytometry and real-time PCR. Results Donor SP and MSC were reached to lungs and gastrointestinal (G-I) tract, and lymph nodes (LN) sequentially, and transit time and localization site of these cells were very similar. The mRNA expression of Foxp3 in regional LN localized with T cells was markedly increased by addition of C3H10T1/2 cells in real-time PCR. Using mixed lymphocyte reaction I determined the optimal SP proliferation inhibition dose (MSC: SP ratio = 1:2 and 1:1). The clinical and histological GVHD score and Kaplan-Meier survival rate were improved after MSC transplantation in dose-dependent manner. Conclusion MSC inhibit GVHD in a dose-dependent manner in this mouse model and this model can be used to study the effects of MSC on GVHD.