Effect of glucose/oxygen deprivation and reperfusion on the changes of the synapsinⅠ and phosphosynapsin in organotypic hippocampal slice culture

Abstract

Brain ischemia leads to neuronal damage and dysfunctions including excessive neurotransmitter release by the potentiated intracellular Ca^(2+) influx. Synapsin I is believed to be involved in regulating the release of neurotransmitters via exocytosis and its interaction with the actin filaments and synaptic vesicles is regulated by phosphorylation. Because the exocytosis and synapsin I phosphorylation are a Ca^(2+)-dependent process, it is possible that the ischemic insult modifies the presynaptic proteins. However, the effect of glucose/oxygen deprivation (GOD) and reperfusion induced neuronal damage on the changes in synapsin I and its phosphorylation level in organotypic hippocampal slice cultures have not been established. This study examined the effect of GOD and reperfusion on the neuronal damage and the changes in the presynaptic proteins in organotypic hippocampal slice cultures. PI fluorescence, cresyl violet staining, transmission electron microscopy, and immunofluorescence far NeuN were used to the measure the extent of neuronal damage. In order to determine the changes in the presynaptic proteins, the synapsin I or phosphosynapsin level was measured by either immunofluorescene or western blot analysis. The PI fluorescence was observed in the CA1 area after GOD for 30 minutes, which could be detected in the whole pyramidal cell layer during reperfusion for 24 hrs. The immunofluorescence of NeuN had a negative correlation with PI fluorescence. During GOD and reperfusion, the immunofluorescence of synapsin I in addition to the synapsin I protein level increased in the stratum radiatum and the stratum oriens of the CA1 area and the stratum lucidum and the stratum of the CA3 area. The phosphosynapsin level evidently increased in the stratum lucidum of the CA3 area after GOD for 30 minutes, which was reduced to the control level after reperfusion. These results suggested that the increase in the synapsin I and its phosphorylation level might play an important role in modulating the exacerbated neurotransmitter release via exocytosis during neuronal damage as well as degeneration induced by glucose/oxygen deprivation and reperfusion.;생체의 허혈 모델에서 포도당/산소 고갈과 재관류는 세포내로 칼슘 이온의 유입을 증가시키고 과도한 신경전달물질의 유리를 포함한 신경 세포의 손상 및 기능 장애를 초래한다. 신경전달물질의 유리과정은 actin filament에 신경소포체를 붙들어 매어주는 synapsin I의 인산화 과정에 의해 조절되는데, 이는 또한 칼슘 이온의 유입에 의하여 조절된다. 본 연구에서는 배양 해마절편에서 포도당/산소 고갈과 재관류에 의하여 초래되는 신경세포 손상 및 접합 전 신경 연접부 단백질의 변동을 조사하였다. 신경세포의 손상은 PI 형광 염색, cresyl violet 염색, 투과전자 현미경, NeuN의 면역 형광 염색을 이용하여 측정하였다. 또한 접합 전 신경 연접부 단백질의 변동을 알아보기 위하여, synapsin I 또는 phosphosynapsln의 면역형광 염색 및 western blot을 시행하였다. 포도당/산소 고갈 30분 후에 CA1 부위에서 신경세포의 손상이 나타나기 시작하여 재관류 6시간, 24시간에는 모든 pyramidal 신경세포층에서 손상이 나타났다. 이러한 신경세포의 손상은 CA3 부위보다 CA1부위에서 먼저 나타나고 더 심하게 나타났다. 포도당/산소 고갈과 재판류시 synapsin I의 면역형광 정도와 단백질 변동 은 CA1 부위와 CA3부위에서 모두 증가하였다. Phosphosynapsin은 포도당 /산소 고갈로 인하여 CA3부위에서만 증가되었다가 재관류시에는 다시 대조군에서 보여지는 면역 형광정도로 감소되는 것을 관찰하였다. 그러므로 포도당/산소 고갈 및 재관류로 인한 신경세포의 손상이 진행되는 동안 synapsin I 및 이의 인산화는 세포외 방출기전을 통해 신경전달 물질 유리를 증가시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.