Heparin이 수근관 증후군 횡수근 인대에서 추출한 섬유아세포의 Collagen, MMP(matrix metalloproteinase) 및 TGF-β isoforms 의 발현에 미치는 영향에 대한 연구

Abstract

Background and Objectives; The characteristic histology of carpal tunnel syndrome (CTS) is noninflammatory synovial fibrosis of transverse carpal ligament and synovial sheath. Recent morphometric studies have demonstrated that the dysplastic collagen fibers are irregularly arrayed and the quantity of it was altered. Molecular studies revealed fibroblast proliferation and collagen production due to altered levels of certain growth factors and enzymes such as transforming growth factor-β (TGF-β) and matrix metalloproteinase (MMP). While TGF-β1 and TGF-β2 are known to have fibrogenic effect on fibroblast, TGF-β3 has anti-fibrogenic effect on collagen synthesis. In addition, gelatinases, one of the various kinds of MMP, have similar substrate specificities, degrading type Ⅳ and Ⅴ collagen, gelatin, elastin, and so on. While heparin is known to have anti-inflammatory and anti-proliferative effect on fibroblast as well as anti-angiogenic effect on perivascular tissue. The purpose of this study was to examine the effect of heparin on the level of expression of TGF-β isoforms, MMP-2, 9 and type Ⅰ, Ⅲ collagen mRNA in cultured human normal and CTS fibroblasts cultures from transverse carpal ligament. Materials and Methods; The normal and CTS fibroblasts were cultured from transverse carpal ligament and exposed to 0(control), 1, 10, 100 μg/ml of heparin for 24hours. Then TGF-β isoforms, MMP-2, 9 and type Ⅰ, Ⅲ collagen mRNA were detected with a reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique and analyzed with a computerized densitometry (Scion image program). Results; In CTS fibroblasts, the expression of type Ⅰ, Ⅲ collagen and TGF-β2 mRNA was significantly increased compared to normal fibroblast. And heparin significantly decreased expression of type Ⅰ and Ⅲ collagen mRNA. However the expression of TGF-β1, β2 and β3 mRNA was not changed significantly by heparin. In CTS fibroblasts, heparin (100 μg/ml) decreased production of TGF-β1 and 3 mRNA, however, in other concentration of heparin TGF-β1, β2 and β3 mRNA showed various responses. In high concentration of heparin, MMP-2 mRNA of CTS was enormously increased, while MMP-9 mRNA was decreased. To sum up, in CTS, heparin inhibited the expression of type Ⅰ and Ⅲ collagen mRNA and promoted the fibrolytic activity of MMP-2. Conclusion; We concluded that heparin influences on fibroblasts by inhibiting type Ⅰ, Ⅲ collagen synthesis directly and shows its fibrolytic effect through MMP2 system, but TGF-β isomers showed little relation to the antifibrogenic effect of cultures fibroblasts.;수근관 증후군의 특징적인 조직학적 소견은 비염증성 건초 섬유화(noninflammatory synovial fibrosis)이며 반복되는 수부외상이 중요한 역학적 인자로 알려져 있다. 현재까지 수근관 증후군 환자의 횡수근 인대의 조직학적 연구는 있었지만 collagen 및 cytokine의 변화에 대해서는 알려진 바 없다. 최근 헤파린이 조직의 섬유화 반응을 억제 시키는 약물이며 간질성 폐 섬유화증이나 당뇨성 사구체 경화증의 치료에 효과적이라는 보고가 있었다. 따라서 저자는 수근관 증후군 환자의 횡수근 인대에서 배양된 섬유아세포의 Type Ⅰ. Ⅲ collagen과 창상의 치유과정에 중요한 역할을 하는 TGF β isoforms(β1,2,3) 및 세포외 기질분해 효소중 collagen의 대사 과정에 중요한 matrix metalloproteinase(MMP) 2, 9의 변화를 정상인과 비교 측정하고 heparin 투여시 그 변화를 관찰하였다. 수근관 증후군 환자 5명과 수근관 증후군의 기왕력이 없는 수부 외상 환자 5명(대조군)에서 3mm³ 크기의 횡수근 인대를 채취하였다. 채취한 검체를 collagenase type Ⅰ(Sigma, U.S.A)으로 녹인 후 10% fetal bovine serum과 antibiotic-antimycotic DMEM 배지에서 24시간 배양하였다. 그 후 0.05% EDTA로 분리하고 10% PBS 10% FBS로 세척한 후 다시 원심 분리 하여 계대배양 하였다. heparin을 다른 농도 (0,1,10,100 ug/ml)로 투여하고 collagen 과 cytokine의 mRNA 발현을 보기 위해 reverse transcription PCR 을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. CTS 환자군의 섬유아세포는 Type Ⅰ, Ⅲ collagen의 발현이 증가 되어 있었다. (p<0.05) 2. Heparin 투여는 Type Ⅰ, Ⅲ collagen의 발현을 유의하게 감소시켰다. (p<0.05) 3. CTS 환자군에서 TGF-β2의 발현이 증가 되었으며 고농도의 heparin 투여시 TGF-β1, TGF-β3의 발현이 감소되었다. (p<0.05) 4. CTS 환자군에서 matrix metalloproteinase(MMP)2의 발현은 증가되어 있었으며 고 농도의 heparin 투여시 발현이 유의하게 증가 되었다. 이상의 결과로 볼 때, 정상군에 비해 CTS 환자의 횡수근 인대에서 배양한 섬유아 세포는 Collagen Type Ⅰ, Ⅲ의 발현이 증가 되어 있으며 헤파린에 의해 type Ⅰ, Ⅲ collagen mRNA의 발현이 감소되는 것으로 보아 헤파린은 직접적으로 type Ⅰ, Ⅲ collagen의 생성을 억제시켜 항 섬유화 작용을 보인다. 수근관 증후군 섬유아세포에서 고농도의 헤파린에 의해 섬유 증식 촉진 인자인 TGF-β1 mRNA 발현이 감소하나 오히려 섬유 증식 억제 인자인 TGF-β3 mRNA는 감소되는 것으로 보아 TGF β isoforms는 CTS 환자의 횡수근 인대의 병인에 직접적으로 관여하는 인자로 보기 어렵다. 고농도 헤파린에 의해 수근관 증후군의 섬유아세포 gelatinase A(MMP-2) mRNA가 증가되는 것으로 보아 헤파린은 gelatinase A(MMP-2)에 의한 콜라겐 대사를 촉진시켜 치료 목적에 이용될 가능성을 제시하였다.