Regulatory Mechanisms of Apoptosis and Angiogenesis by Prothymosin alpha

Abstract

Prothymosin alpha (PTα) is an abundant nuclear protein involved in chromatin remodeling associated with cell proliferation and growth in mammalian cells. PTα gene expression is up-regulated by c-myc and it is highly abundant in rapidly dividing cancer cells. Recent findings have demonstrated that PTα is involved in the regulation of mitochondria-initiated caspase-3 activation. To explore whether PTα can be a potential target for cancer molecular therapy, I have searched for PTα-interacting proteins involved in apoptosis and angiogenesis and investigated its mechanism of action using cellular, molecular and biochemical approaches. To screen for PTα-interacting proteins involved in apoptotic pathway, human ovary cDNA library was used in yeast two-hybrid screening. Calreticulin (CRT) was identified as a PTα-interacting protein. CRT, a central regulator of Ca^(2+)homeostasis, is involved in both apoptosis and angiogenesis that are critical for tumor growth. Co-immunoprecipitation and confocal laser scanning microscopy confirmed interaction of PTα and CRT in mammalian cells. Deletion mutant analysis has identified that C-terminal 96 amino acids (322-417) of CRT interacts with N-terminal 31 amino acids of PTα (1-31). To further confirm the role of PTα in apoptosis and angiogenesis, expression of PTα is silenced by small interfering RNA (siRNA). Silencing of PTα induces apoptosis upon ultraviolet (UV) irradiation and increases the activity of caspase-3 and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage. Also, inhibition of endogenous PTα expression by siRNA sensitizes cells to UV-induced apoptosis in human cancer cells. To examine the role of PTα in human vascular endothelial cells (HUVECs), endogenous PTα expression is silenced by siRNA. Significant inhibition of VEGF-induced endothelial cell proliferation, migration, invasion, and tube formation is observed, suggesting the pivotal role of PTα in angiogenesis. Taken together, inhibition of endogenous PTα not only induces apoptosis in cancer cells but also inhibits angiogenesis in HUVECs. These findings suggest that PTα may be an ideal novel target for anti-cancer therapy.;Prothymosin alpha은 대부분의 세포에 존재하며 세포증식과 성장에 중요한 chromatin-remodeling에 관여하는 핵단백질이다. Prothymosin alpha유전자의 발현은 종양유전자인 c-myc 유전자의 의해 조절되며 세포증식이 활발한 종양세포에서 과다 발현 되어있다. 또한prothymosin alpha가 미토콘드리아에 의해 매개되는 세포사멸기전을 조절하는데 관여한다는 것이 최근에 보고되고 있다. 대부분의 종양세포에서 과다 발현되고 있으며, 암세포의 증식과 성장에 중요한 prothymosin alpha가 종양치료를 위한 새로운 유전자치료의 타겟이 될 수 있는지를 탐색하기 위하여, 본 연구에서는 세포 분자생물학적, 생화학적 연구 분석방법을 통하여 prothymosin alpha 와 결합하는 단백질을 동정하고 그 작용기전을 규명하였다. 인체 난소조직에서 유래한 cDNA library를 yeast two-hybrid 분석방법을 통해 스크리닝하여 prothymosin alpha에 결합하는 단백질을 동정한 결과 calreticulin 이 prothymosin alpha에 결합하는 것을 찾아냈다. Calreticulin은 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 에 존재하는 Ca^(2+)-homeostasis에 중요한 조절인자로서 세포사멸 및 종양의 성장에 중요한 혈관신생에 관련되는 단백질이다. 인체 세포주에서 두 단백질이 상호작용 하는지는 co-immunoprecipitation 분석방법을 사용하여 확인하였으며, 두 단백질의 세포 내 localization은 confocal laser microscopy분석방법을 통해 확인하였다. 또한 유전자 재조합 도메인 mapping 분석방법을 사용하여 calreticulin의 카복실기에 위치하는 96개의 아미노산으로 이루어진 부분 (322-417) 과 prothymosin alpha의 아미노기 부위에 위치하는 31개 아미노산 (1-31) 으로 이루어진 부분이 상호 작용한다는 결과를 얻었다. 또한 prothymosin alpha가 세포사멸과 혈관신생에 미치는 영향을 규명하기 위하여, 암세포에서 과다 발현되어있는 prothymosin alpha의 발현을 small interfering RNA (siRNA) 방법을 통해 억제 시켰다. Prothymosin alpha siRNA 를 처리하였을 때 유전자의 손상을 가져오는 UV irradiation을 암세포에 처리 시 대조군에 비해 세포사멸이 현저히 유도되었으며, 세포사멸에 중요한 단백질들인 caspase-3 와 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 단백질의 cleavage가 증가되었으며, 활성 또한 증가되었다. 또한 혈관내피세포에서 prothymosin alpha 의 발현을 억제 시켰을 때, 혈관내피세포성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 에 의해 유도되는 혈관내피세포의 증식 (proliferation), 이동 (migration), 침윤 (invasion) 등이 억제되었으며 혈관내피세포의 관형성 (tube formation) 이 억제되는 결과를 통해 prothymosin alpha가 직접적으로 혈관신생에 중요함을 확인하였다. 본 연구결과는 종양세포에서 과다 발현되는 prothymosin alpha의 발현을 억제 시킴으로써 세포사멸을 유도할 수 있을 뿐만 아니라 종양의 성장에 중요한 혈관신생도 저해할 수 있으므로 prothymosin alpha가 분자치료의 새로운 타겟후보가 될 수 있음을 제시하는 것으로 사료된다.