Molecular mechanisms underlying cAMP inhibition of macrophage dependent TNF-α production and neurotoxicity in response to amyloidogenic C-terminal fragment of Alzheimer's amyloid precursor

Abstract

This study is to characterize the intracellular pathway involved in macrophage production of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and the neurotoxicity in response to the 105 amino acid carboxylterminal fragment (CT105) of amyloid precursor protein, a candidate of alternative toxic elements in Alzheimer's disease (AD) pathology, and the molecular mechanisms by which cyclic AMP (cAMP) regulates the neurotoxic inflammatory signaling cascade. CT105 synergistically with interferon-γ (IFN-γ) elicited a robust and sustained increase of TNF-α production in comparison to beta amyloid (Aβl-42) through enhanced TNF-α mRNA transcription, mediated via increased nuclear factor-kappaB (NF-κB) activities in macrophages derived from human monocytic THP-1 cells. Results of mechanistic analysis revealed that cAMP analog, dibutyryl cyclic AMP (dbcAMP) or an adenyl cyclase inhibitor, forskolin effectively suppressed the CT105-induced TNF-α production by reducing nuclear translocation and DNA binding activity of NF-κB. The inhibitory mechanisms manifested by dbcAMP included decreased phosphorylation/degradation of inhibitor of NF-κB (IκB) followed by increased its synthesis/stability. Importantly, CT105 conditioned media exerted toxicity to human SH-SY5Y neuronal cells and anti-TNF-α antibodies blocked the conditioned media-mediated neurotoxicity. Moreover, additions of dbcAMP or forskolin prior to stimulation of THP-1 cells protected neuronal cells from toxicity. These findings provide the evidence supporting the more potent immunological role of CT105 than Aβ1-42 in inducing microglia/macrophages to elicit NF-κB-mediated inflammatory signals for excess TNF-α production that ultimately leads to the neurotoxicity. In addition, the detailed inhibitory mechanisms of cAMP actions imply that an increase of cAMP levels could be benefit against AD progression. ;본 연구는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 독성 물질의 하나로 최근 대두되고 있는 C단 아밀로이드 전구 단백질(CT105)에 의한 인간 대식세포 면역 활성화 및 간접적인 신경세포 독성기전을 규명하기 위하여, CT105에 반응하여 활성화된 인간 대식세포에서의 TNF-α생성과 이로 인해 나타나는 신경독성 염증 반응을 알츠하이머병의 주독성 물질중 하나인 beta-amyloid (Aβl-42)와 비교하여 고찰하였다. 또한 이들 CT105 또는 Aβl-42에 의한 인간 대식세포 면역 활성화로 인한 신경독성 염증반응을 조절하는 cyclic AMP (cAMP)의 분자 생물학적 작용기작들을 분석해 보았다. CT105는 IFN-γ과 상승작용에 의하여 인간 THP-1 세포주로부터 분화된 대식세포를 활성화시켜 Aβl-42와 비교할 때 훨씬 적은 농도에서 다량의 TNF-α를 생산 분비하였다. EMSA와 Western blot으로 CT105 또는 Aβl-42에 의한 대식세포의 면역 활성화 과정을 분석해 볼 때, nuclear factor kappa B (NF-κB) 신호전달경로가 주로 활성화됨으로써 NF-κB의 핵내 이동과 DNA결합능력이 상승되어 NF-κB의 활성도를 증가시키고, 이로 인해 TNF-α mRNA의 전사가 증대되는 결과로 인하여 TNF-α의 유전자 발현이 증가되는 기작이 관련됨을 시사하였다. IFN-γ와 달리 cAMP를 올리는 물질들, 즉 cAMP의 유사체인 dibutyryl cyclic AMP와 adenyl cyclase 억제제인 foskolin이 CT105이나 Aβl-42에 의한 대식세포에서 TNF-α 생성을 억제시키는 것이 관찰되었다. cAMP에 의한 TNF-α 생성 억제 작용기작은 cAMP가 CT105나 Aβl-42에 의해 활성화된 NF-κB의 핵내 이동과 DNA결합능력을 감소시켜 효과적으로 TNF-α 생성을 억제하는 것으로 분석되었다. 특히 이러한 cAMP의 NFκB 활성도 억제기능은 IκB (inhibitor of NF-κB)를 통해서 일어나는데 그 과정을 보면 초기엔 IκB의 인산화 및 분해의 감소를 통하여, 후기엔 IκB의 합성과 안정성을 증가시켜 NF-κB와 IκB로 이루어진 이분체가 해리되는 것을 막음으로써 일어나는 것으로 고찰되었다. 한편, CT105 또는 Aβl-42를 THP-1 분화 대식세포에 처리하여 얻어진 배지(conditioned media)는 사람 신경세포주인 SH-SY5Y에 독성을 나타내며 이때 conditioned media의 신경독성능은 분비된 TNF-α 농도에 의존적으로 비레함을 관찰하였다. 이 과정에서 중화항체를 처리할 경우 배지의 신경독성능은 유의하게 차단되었고, 또한 CT105또는 Aβl-42으로 반응시키기 전에 THP-1 분화 대식세포를 dbcAMP나 foskolin으로 처리하여 TNF-α 생성을 차단시켜 얻어진 배지들도 SH-SY5Y세포를 독성으로부터 보호해 주었다. 본 연구 결과는 아밀로이드 전구 단백질의 과도한 발현이나 alternative processing에 의해 생겨난 Aβ를 포함하고 있는 CT가 알츠하이머병의 주 독성 물질중의 하나일 것이라는 가설을 지지해 줄 뿐만 아니라, Aβ보다 훨씬 적은 농도에서 CT가 신경 독성 염증반응을 유발시키는데 있어서 주로 NF-κB 신호전달경로 활성화에 의해 다량으로 생산된 TNF-α가 매우 중요한 독성인자로 작용할 수 있으며, cAMP가 이러한 대식세포 활성화에 의한 신경독성 염증반응을 억제할 수 있다는 것과 cAMP의 면역억제 작용기작을 분자 생물학적으로 상세히 규명해주고 있다. 따라서 cAMP를 올려주는 물질들이 CT105나 Aβl-42에 대한 대식세포 활성화로 의한 신경독성 염증반응을 감소하여 알츠하이머병의 악화를 지연시키는데 유용하게 쓰일 가능성을 제시해 준다.