N-acetylcysteine promotes apoptotic cell clearance and the resolution of inflammation

Abstract

Background: The phagocytosis of apoptotic cells (termed ¨efferocytosis〃) innvitro and in vivo has an anti-inflammatory effect. Oxidative stress plays an important role in the pathogenesis of lung injury and inhibits efferocytosis by macrophages in vitro. Objective: In this study, the animal model of intense inflammatory lung injury was first developed. Next, the in vivo effects of an antioxidant, N-acetylcysteine (NAC), on efferocytosis by alveolar macrophages (AMs) during intense lung inflammation associated with oxidative stress, and the induction of inflammatory responses, were determined. The relation between the effect of NAC on efferocytosis and the changes in the lung…s inflammatory responses to LPS was found. In addition, the role of oxidant-dependent RhoA in the regulation of efferocytosis was evaluated in the same animal model. Methods: Lipopolysaccharide (LPS, 4.5 mg/kg) was intratracheally admini-stered to mice. NAC (200 mg/kg) was first administered 2 h before LPS treatment, and thereafter, every 12 h until the mice were sacrificed. The animals were randomly divided into four groups: the saline, saline+NAC, LPS, and LPS+NAC groups. Measurements and Main Results: Neutrophil accumulation, apoptosis of the brochoalveolar lavage (BAL) cells that occurred mainly in the neutrophils, and the oxidant production of BAL cells and AMs peaked at 3 d post-LPS. NAC significantly enhanced the apoptotic cell clearance in vivo and ex vivo and inhibited the RhoA activity in the AMs at 3 d post-LPS. NAC inhibited the LPS-induced increase in the proinflammatory mediators, including TNF-alpha and MIP-2 production and MMP-9 activity, but enhanced TGF-beta 1 secretion in both the BAL fluid and the AMs. The TNF-alpha levels were reduced when the AMs were exposed to the ex vivo apoptotic Jurkat cells, but the TGF-beta 1 levels were enhanced in LPS+NAC group. In addition, NAC inhibited the LPS-induced increases in the inflammatory-cell numbers into the lung and total protein contents in the BAL fluid. Y-27632 (an inhibitor of the RhoA/Rho kinase pathway) pretreatment mimicked the effects of NAC on the in vivo apoptotic cell clearance and on the production of proinflammatory mediators and TGF-beta 1 at 3 d post-LPS. Conclusions: NAC enhances apoptotic cell clearance through the inhibition of RhoA activity in the AMs and concomitantly reduces TNF-alpha production but increases TGF-beta1 production during LPS-induced intense lung inflammation. An antioxidant, NAC, or the RhoA/Rho kinase blockers, can offer therapeutic strategies that can hasten the resolution of lung inflammation.;연구 배경: 사멸된 염증세포를 인식하여 탐식하는 작용 (efferocytosis) 은 염증의 주변으로부터 사멸화 세포 (apoptotic cell)를 제거함으로써 염증 소멸을 주도하는 주요 방어체계이다. 폐손상의 병리적 기전에 중요한 역할을 한다고 알려진 활성산소종 (Reactive Oxygen Species; ROS)은 대식세포 (macrophage)에 의한 사멸화 세포 탐식능력을 저해함으로써 과도한 염증과 손상된 조직의 복구 불능으로 인한 심각한 질병을 유도한다. 연구 목적: 본 연구에서 실험용 생쥐를 이용하여 중증 폐염증 동물 모델을 개발하였다. 다음 단계에서 산화적 스트레스 (Oxidative-stress)로 인한 중증 폐염증 동물 모델에서 항산화제인 NAC (N-acetylcysteine)의 세포탐식 능력 증진을 규명한다. 또한 NAC에 의한 세포탐식 능력의 교화로 인한 염증 반응의 변화를 관찰한다. 더 나아가, 이러한 염증 상황에서 세포탐식 능력을 조절하는 산화 의존적 GTP-결합단백질인 RhoA의 역할을 밝히고자 한다. 연구 방법: 실험용 생쥐에 내독소 (lipopolysaccharide; LPS, 4.5 mg/kg)를 기도에 투여하여 중증 폐염증을 유발하였다. NAC (200 mg/kg)을 1일 2회 복강 투여하여, 활성산소종의 사멸화 세포 탐식능력과 그로 인한 염증반응의 해소 기전을 탐색하였다. 실험 동물군은 생리적 식염수 투여군, 생리적 식염수+NAC 군, 내독소 투여군, 그리고 내독소+NAC 투여군으로 나누어 실험 하였다. 연구 측정 및 주요 결과: 호중구 (neutrophil)의 유입량, 기관지 세척액 세포 (Bronchoalveolar lavage cells; BAL cells)의 사멸화, 기관지 세척액 세포와 대식세포에의한 활성산소종의 생산량이 내독소 투여 후 3일에 최고치에 달하였다. NAC에 의해 내독소 투여 후 3일에 대식세포의 사멸화 세포 탐식 능력과 RhoA의 활성이 억제되었다. 또한, NAC은 기관지 세척액 내와 대식세포에서 염증유발인자인 TNF-alpha, MIP-2의 양과 단백질 분해 효소인 MMP-9의 활성은 감소시켰으나, 항 염증유발인자인 TGF-beta의 양은 증가시켰다. 내독소 투여군 내독소+NAC 투여군의 동물 모델의 기관지 세척액에서 분리한 대식세포에 사멸화 세포를 준 후 배양액 내의 TNF-alpha와 TGF-beta의 양을 측정하였다 .내독소+NAC 투여군에서 내독소투여군에 비해 TNF-alpha의 양은 감소하고 TGF-beta은증가하였다. 또한 NAC은 내독소에 의한 폐 내의 염증세포의 유입, 폐세척액내의 전체 단백질량을 감소시킨다. RhoA 인산화 효소 (RhoA kinase; ROCK)의 억제제 Y-27632을 전처리 하였을 때, 대식세포의 사멸화 세포 탐식 능력의 증가와 염증 유발인자의 감소, 항염증 유발 인자의 증가 등은 NAC을 처리하였을 때와 유사한 효과를 보였다. 연구 결론: 내독소로 인한 중증 폐염증에서 NAC은 RhoA의 활성을 조절함으로써 대식세포에 의한 사멸화 세포의 인식, 탐식 능력을 증가시켰고, 이와 동시에 염증유발인자 TNF-alpha는 감소 시키고 항 염증유발 인자인 TGF-beta1의 분비를 증진시켰다. 항산화제, NAC 혹은 RhoA와 Rho 인산화 효소 억제제를 이용함으로써 폐염증 완화를 증진시킬 수 있는 새로운 치료제 개발을 제안 할 수 있다.