(Na,K)ATPase와 cofilin사이의 binding site에 관한 연구

Abstract

The (Na,K)ATPase, an α, β heterodimer, is found in the plasma membrane of all animal cells and believed to have 8-12 transmembrane regions. One of the functional domain of the a subunit of (Na,K)ATPase is the 3rd cytoplasmic loop between the fourth and fifth transmembrane regions (H4-H5) of (Na,K)ATPase. In the previous work (Yoon and Guidotti, submitted), the 3rd cytoplasmic domain of the a subunit was found to interact with cofilin which is an actin-modulating protein by the two-hybrid system. I demonstrated that cofilin interacted only with the 3rd cytoplasmic domain but not with the lst, 2nd, 4th, and 5th cytoplasmc domains of the α2 subunit and the cytoplasmic region of the β subunit of (Na,K)ATPase. I also demonstrated that cofilin interacted only with the large cytoplasmic loop of the isoforms of (Na,K)ATPase, but not with that of Glut1 and Glut4. I introduced 6 mutations in 3rd cytoplasmic domain of (Na,K)ATPase to identify the binding sites with the cofilin. Five of these mutants were single amino acid substitution (R417Q, K470Q, K654G, R700G, D710G) and one was double mutant in which lys-654 and arg-700 were simultaneously changed to gly-654 and gly-700. Activity analysis of the reporter gene of these mutants has shown that both of lys-654 and arg-700 of the 3rd cytoplasmic loop of (Na,K)ATPase are involved in its interaction with cofilin but not profoundly with other mutants. I also introduced 5 mutations (E50Q, E51Q, D59N, D65N, and D66N) in cofilin construct to identify the binding sites with the 3rd cytoplasmic loop of (Na,K)ATPase. Activity analysis of the reporter gene of these mutants has shown that glu-50, glu-51, asp-65, asp-59 and asp-66 is not involved in its interaction with the 3rd cytoplasmic loop of (Na,K)ATPase. Therefore, I conclude that the ionic affinity between the 3rd cytoplasmic loop of (Na,K)ATPase and the residue 45-67 of cofilin are not involved in their interaction. These results also suggest that the 3rd cytoplasmic domain of the (H,K)ATPase might interact with cofilin since it contained the positively charged lys and arg residues which correspond to the binding position of the 3rd cytoplasmic loop of (Na,K)ATPase.;모든 동물의 세포막에 존재하는 (Na,K)ATPase는 α와 β subunit으로 구성되어 있으며 8-12개의 transmembrane domain을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. (Na,K)ATPase α subunit의 cytaplasmic domain 중 functional region은 loop3인데, two-hybrid system을 이용한 실험에서 이 부분과 actinmodulating protein인 cofilin과의 상호작용이 발견된 바 있다 (Yoon and Guidotti, submitted). Yeast two-hybrid system을 이용해 실험해 본 결과 cofilin과의 상호작용에 있어 (Na,K)ATPase의 loop3 부분이 주로 관여함을 알 수 있었고 다른 cytoplasmic domain에서는 cofilin에 대한 affinity가 나타나지 않았다. 또한 cofilin은 transmembrane protein의 일종인 Glut1과 Glut4의 가장 큰 cytoplasmic domain과는 상호작용하지 않았다. Cofilin과의 상호작용에 관여하는 (Na,K)ATPase의 residue들을 알아내기 위해 loop3부분에 6개의 mutation을 도입하였다. 이들 mutant 중 5개는 하나의 amino acid를 치환한 것이고 (R417Q, K470Q, K654G, R700G, D710G), 나머지 하나는 K654G·R700G의 double mutant이다. 이 mutant들의 reporter gene에 대한 activity analysis는 (Na,K)ATPase α subunit의 residue lys-654와 arg-700이 cofilin과의 상호작용에 관여함을 시사해 준다. 또한 (Na,K)ATPase와의 상호작용에 관여하는 cofilin의 site들을 알아내기 위해 clone 267 construct에 5개의 mutation을 도입하였다. 이 mutant들의 reporter gene에 대한 activity analysis는 residue 45-67 사이에 있는 negative charged amino acid들이 (Na,K)ATPase와의 상호작용에 관여하지 않음을 보여준다. 따라서 (Na,K) ATPase α subunit의 loop3 부분과 cofilin의 residue 45-67사이에서의 ionic affinity는 (Na,K)ATPase와 cofilin사이의 상호작용에 기여하지 않음을 알 수 있었다. 이상의 결과들은 또한 (Na,K)ATPase의 residue lys-654와 arg-700에 상응하는 residue를 가지고 있는 (H,K)ATPase 역시 cofilin과 상호작용할 수 있는 가능성을 제시하여 준다.