Development of immunoliposomal gene delivery system

Abstract

유전자 치료는 암을 포함한 여러 질병의 예방, 치료하고 개선하는데 있어서 하나의 대안으로 대두되고 있다. 유전자를 질병의 치료에 성공적으로 이용하기 위해서는 치료에 이용되는 유전자를 효과적이고 선택적으로 원하는 부위에 운반시킬 수 있는 운반체가 필요하다. 이를 위해 여러 연구에서는 recombinant virus 등의 viral vector와 양성 polymer 나 양성 지질 및 liposomse 등의 non viral vector를 이용하여 치료에 사용되는 유전자를 원하는 세포에 운반시키려는 노력을 하였다. 하지만 viral vector는 인체에 사용 시 면역반응을 일으키고, 생체 내에서 빠르게 제거되며, 운반되는 유전자의 크기에도 제한이 있었다. 또한 특정 대사 기관에만 제한적으로 운반 되는 등 효율성이 떨어졌다. Non-viral vector는 viral vector와 같이 인체 내에서 면역반응을 일으키지는 않고, 유전자를 원하는 세포에 선택적을 운반하는데 도움을 주는 다양한 ligand를 결합시킬 수 있는 장점을 가지고 있지만, viral vector에 비해 세포로 유전자를 전달하는 효율이 크게 떨어지며, 양성 지질의 경우 그 자체의 세포 독성이 문제가 되었다. 양성 polymer는 용해성과 생분해성이 떨어지고, 생체 내에서 혈장 단백질과 쉽게 결합하여 빠르게 제거되는 등의 문제점을 가지고 있다. 그러므로 유전자를 질병의 치료와 개선을 목적으로 사용하기 위해서는 생체 내에서 장시간 체류하면서 원하는 세포에 효과적으로 유전자를 전달하고, 세포 내에서 유전자가 발현할 수 있어야 하며, 생체 내에 적용 시 안전한 전달 시스템의 개발이 필요하다. 먼저, Plasmid DNA (pCEP4 clone 790)는 freezing/thawing 방법에 의해 중성지질인 POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 음성지질인 DSPE-PEG 2000 (distearoyl phosphatidyl ethanolamine polyethylene glycol 2000), DSPE-PEG 2000-maleimide과 다른 종류의 양성지질인 DDAB (dimethyl dioctadecyl ammonium bromide)과 DOTAP으로 구성된 liposome 각각 봉입하였다. 이러한 liposome의 크기는 pore size가 200 nm, 100 nm인 polycarbonate filter를 통과시켜 조절하였으며, thiolated monoclonal antibody를 liposome을 구성하는 linker lipid인 DSPE-PEG 2000 maleimide에 접합시켜 pegylated immunoliposome을 제조하였다. Sepharose CL-4B column chromatography에 의해서, plasmid DNA를 함유한 pegylated immunoliposomes는 liposome에 연결되지 못한 IgG와 liposome 안으로 봉입되지 못하고 밖에서 분해된 DNA와 분리되었다. Liposome내로 plasmid DNA를 봉입하는데 영향을 미치는 요소들을 알아보기 위해서 양성지질인 DDAB나 DOTAP의 농도, Plasmid DNA의 양과 지질의 양을 변화시켜 보았다. 그 결과, liposome 내로 봉입되는 DNA의 양은 양성지질의 농도가 증가함에 따라 상당히 증가함을 알 수 있었다. 또한 Plasmid DNA의 양을 10 에서 300 μg까지 증가시켰을 경우와 liposome을 구성하는 지질의 양을 10 μmole에서 30 μmole까지 증가시켰을 경우 모두, liposome 내로 봉입되는 DNA의 양이 증가하였다. 또한 liposome 을 구성하는 양성 지질의 종류가 달라짐에 따라 liposome내로 봉입되는 DNA의 양상과 그 양이 달라지는 것도 알 수 있었다. 다음으로 anti-EGFR 225 MAb를 plasmid DNA를 함유한 liposome에 접합시켜 immunoliposome을 제조하였다. 225 MAb 는 다양한 고형암세포에서 과다발현 되는 epidermal growth factor receptor (EGFR)를 targeting 하는데, 이는 유전자를 함유하는 225 MAb conjugated liposome을 confocal microscopy로 관찰한 결과에서 알 수 있었다. 225 MAb conjugated immunoliposome는 EGFR이 과다 발현된 A-431 human epidermoid carcinoma cell에 빠르게 결합하여 세포 내로 도입되었고, 세포질로 분포되는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서 제조된 EGFR-targeted immunoliposome은 선택적이고 효과적인 유전자 전달 시스템으로 개발될 수 있을 것이다.;Gene therapy promises to prevent, treat or cure various disorders such as cancer. To success gene therapy, the vector systems, which can delivery therapeutical gene efficiently and selectively to the target site, are required. Viral vectors such as recombinant viruses and non viral vector such as cationic polymer and cationic liposome have been demonstrated as useful vectors both in vitro and in vivo. However, the use of viral vectors is limited due to immunogenicity, size limitation of gene carried, rapid inactivation in vivo and limiting gene delivery. Non-viral vectors have been investigated as the alternatives to the viral system. Although non-viral vectors are have low immunogenicity and can conjugate various ligands for targeted gene delivery, cationic lipid/DNA complexes (lipoplexes) are limited by relatively low transfection efficiency compared with viral vectors and cytotoxicity in vitro and in vivo. Also, cationic polymers have many problems such as poor solubility and biodegradability, rapid plasma protein binding and clearance from the circulation, and toxicity. Therefore, it is necessary to develop the gene delivery system that has long systemic circulation time, sufficient safety in vivo, and greater gene expression in the target site. For this purpose, plasmid DNA (pCEP4 clone 790) was entrapped in the liposome composed of neutral lipid, POPC, anionic lipids, DSPE-PEG 2000 and DSPE-PEG 2000-maleimide and cationic lipid, DDAB or DOTAP by freezing/thawing method. The liposomes carrying plasmid DNA were extruded through polycarbonate filter with 200 and 100nm pore size to adjust the liposome size. Then, the thiolated anti-EGFR monoclonal antibody (225 MAb) and linker lipid, DSPE-PEG 2000 maleimide in the liposome were conjugated and immunoliposomes carrying plasmid DNA were separated from free plasmid DNA and free IgG by Sepharose CL-4B column chromatography. The factors influencing on the encapsulation of DNA into the liposome, were investigated. The amount DNA entrapped into liposome was significantly increased as concentration of cationic lipids, DDAB or DOTAP was increased. As the initial plasmid DNA and the total lipid amount were increased from 10 to 300 μg and from 10 to 30 μmole, respectively, the DNA amount encapsulated into the liposomes was also raised. However, the pattern of change in DNA amount encapsulated by various factors was somewhat different between DDAB and DOTAP. To confirm the cellular delivery of immunoliposomes carrying plasmid DNA, the 225 MAb conjugated liposomes containing plasmid DNA were monitored by confocal microscopy in the A-431 human epidermoid carcinoma cells, which overexpress epidermal growth factor receptor (EGFR). We found that 225 MAb conjugated liposomes carrying plasmid DNA were rapidly endocytosed to the cells and distributed throughout the cytosol. Based on the results, EGFR-targeted immunoliposome studied in this investigation can be developed as a promising gene delivery system.