Immunoliposomes Carrying Plasmid DNA for Targeted Gene Delivery

Abstract

유전자 치료는 암과 같이 기존의 방법으로 치료하기 어렵다고 알려져 있는 질병을 치료하는 획기적인 방법으로 대두되어 왔다. 이러한 유전자치료를 성공적으로 수행하기 위해서는 유전자를 원하는 세포로만 선택적으로 전달하여 효과적으로 발현할 수 있게 하는 유전자 전달 시스템의 역할이 매우 중요하다. 따라서 본 연구에서는 체내에서 장시간 체류하며, 부작용 없이, 원하는 세포에서만 선택적으로 발현하도록 유전자를 전달할 수 있는 최적의 유전자 송달 시스템을 개발하는 것을 목표로 하였다. 이를 위하여, 본 연구에서는 비바이러스성 유전자 전달 시스템 중 하나인, plasmid DNA를 봉입한 immunoliposome을 제조, 그 특성에 관한 연구를 수행하였다. Plasmid DNA (pGL2 clone 753, pSV clone 756 or pCEP4 clone 790)는 freezing/thawing 방법에 의해 중성지질인 POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 양성지질인 DDAB (dimethyl dioctadecyl ammonium bromide), 음성지질인 DSPE-PEG 2000 (distearoyl phosphatidyl ethanolamine polyethylene glycol 2000)과 DSPE-PEG 2000-maleimide로 구성된 liposome에 봉입하였다. 이러한 liposome의 크기는 pore size가 200 nm, 100 nm인 polycarbonate filter를 순서대로 통과시키는 방법에 의해 조절하였으며, thiolated monoclonal antibody를 liposome을 구성하는 linker lipid인 DSPE-PEG 2000 maleimide에 접합시켜 pegylated immunoliposome을 제조하였다. Sepharose CL-4B column chromatography에 의해서, plasmid DNA를 함유한 pegylated immunoliposomes는 liposome에 연결되지 못한 IgG와 liposome 안으로 봉입되지 못하고 밖에서 분해된 DNA와 분리되었다. Liposome내로 plasmid DNA를 봉입하는데 영향을 미치는 요소들을 알아보기 위해서 먼저 양성지질인 DDAB의 농도를 증가시켜 본 결과, liposome 내로 봉입되는 DNA의 양이 상당히 증가함을 알 수 있었다. 또한 Plasmid DNA의 양을 10 μg에서 200 μg까지 증가시켰을 경우와 liposome을 구성하는 지질의 양을 10 μmole에서 30 μmole까지 증가시켰을 경우 모두, liposome 내로 봉입되는 DNA의 양이 증가하였다. 뿐만 아니라, liposome 내로 봉입되는 DNA의 양은 plasmid DNA의 크기가 증가함에 따라 감소되었으나, liposome의 크기에 의해서는 거의 변화가 없었다. DSPE-PEG 2000 maleimide와 IgG의 비율을 달리하여 liposome에 결합하는 antibody의 수를 조사하여 본 결과, 10 : 1의 비율로 하였을 때 가장 많은 수의 antibody가 결합된 immunoliposome을 제조할 수 있었다. 다음으로 인체 여러 기관들의 고형암세포에서 과다발현 되는 것으로 알려져 있는 epidermal growth factor receptor (EGFR)를 tageting할 수 있는 monoclonal antibody인 225 MAb를 plasmid DNA를 함유한 liposome에 접합시켜 EGFR-targeted immunoliposome을 제조하였다. 이와 같이 제조한 225 conjugated immunoliposome을 confocal microscopy로 관찰한 결과, A-431 human epidermoid carcinoma cell에 과다발현 되어 있는 EGFR에 serum의 존재여부에 상관없이 빠르게 결합하고 세포 내로 도입되었다. 따라서 본 연구에서 제조된 EGFR-targeted immunoliposome은 선택적이고 효과적인 유전자 전달 시스템으로 개발될 가능성이 매우 클 것으로 기대된다.;Gene targeted therapy has become a promising possibility for the treatment of disease such as cancer. The efficacy of gene therapy considerably depends on the delivery system which can efficiently and selectively deliver the gene to the target site with minimal side effect. Therefore, the objective of this study was to develop delivery system capable of both gene delivery and targeting. For the purpose, pegylated immunoliposomes carrying plasmid DNA, as a non-viral gene delivery system, were prepared and characterized. Plasmid DNA (pGL2 clone 753, pSV clone 756 or pCEP4 clone 790) was encapsulated by the freezing/thawing method into the liposomes composed of POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, neutral lipid), DDAB (dimethyl dioctadecyl ammonium bromide, cationic lipid), DSPE-PEG 2000 (distearoyl phosphatidyl ethanolamine polyethylene glycol 2000, anionic lipid) and DSPE-PEG 2000-maleimide (anionic lipid). The liposomes containing plasmid DNA were extruded through two stacked polycarbonate filters with pore size of 200 nm and 100 nm to control the liposome size. Then, thiolated monoclonal antibody molecules (rat IgG or 225 MAb) were conjugated to the liposomes to prepare for the pegylated immunoliposomes carrying plasmid DNA. By Sepharose CL-4B column chromatography, the immunoliposomes containing plasmid DNA were separated from the free plasmid DNA and the unconjugated IgG. The effects of various parameters on DNA amount encapsulated into the liposomes were investigated. As a result, the DNA amount encapsulated was increased according to increasing DDAB (cationic lipid) concentration. By increasing the initial amount of plasmid DNA from 10 μg to 200 μg or the total lipid amount from 10 μmole to 30 μmole, the DNA amount encapsulated into the liposomes was also raised. While an increase in plasmid DNA size resulted in a decrease in the DNA amount encapsulated, liposome size did not influence the DNA amount encapsulated. Also, when the ratio of DSPE-PEG 2000-maleimide to IgG was varied between 5 to 1 and 20 to 1, the highest number of IgG molecules per liposome was observed at the ratio of 10 to 1. To target tumor cells on which epidermal growth factor receptors (EGFR) are mostly overexpressed, anti-EGFR monoclonal antibody 225 was conjugated to the liposomes carrying plasmid DNA. Then, the binding and internalization study was performed by confocal microscopy in A-431 human epidermoid carcinoma cells, which express high level of EGFR. The 225 MAb conjugated liposomes carrying plasmid DNA were rapidly bound and endocytosed to A-431 cells regardless of serum, as a similar pattern to those of 225 MAb. Therefore, the EGFR targeted immunoliposomes prepared and characterized in this study are expected to be a viable gene delivery vector which has long circulation time, low toxicity and great ability to target the disease site.