Study on P-glycoprotein Inhibitory Effects of Natural Compounds

Abstract

Multidrug resistance (MDR) is a major obstacle in clinical cancer treatment. One of the mechanisms involved in the development of MDR is the over-expression of P-glycoprotein (P-gp). It is widely known that compounds found in fruits, vegetables, and medicinal plants not only have anticarcinogenic properties but may also modulate P-gp activity.Therefore, the objective of this investigation was to determine the effects of naturally occurring products on the P-gp activity in human breast cancer cell line, MCF-7/ADR. Cytotoxicity was determined by using sulforhodamine B (SRB) staining assay, and two-hour accumulation of 0.05 μM [³H]-Daunomycin ([³H]- DNM), a P-gp substrate, was investigated in the presence and absence of ten naturally occurring compounds and the effect of these compounds on DNM efflux was determined. Verapamil, a representative P-gp inhibitor, was used as a positive control. As a result, all compounds except for fisetin decreased IC_(50) value of DNM effectively. Biochanin A remarkably increased the accumulation of [³H]-DNM while quercetin and silymarin increased it as much as verapamil. Also, cephalotaxine, morin, and naringenin increased the DNM accumulation significantly while DNM accumulation was decreased by fisetin. Berberine, artemisine and diadzein did not show any effect on the DNM accumulation. The result of efflux study was correlated with that of accumulation study, but only biochanin A, naringenin, and silymarin were statistically significant. In addition, one hundred Indonesian medicinal plant extracts were screened to examine their effects on the P-gp activity. As a result, twenty extracts were evaluated as active samples due to their significant P-gp inhibitory activities. Among them, six kaempferol derivatives of Zingiber zerumbet were isolated and selected as the test samples. All the compounds except for 4"-O-acetylafzelin significantly decreased IC_(50) values of DNM. Especially, kaempferol-3-O-methylether- viii - and kaempferol-3,4'-O-dimethylether exhibited remarkable increase in [³H]-DNM uptake and significant decrease in [³H]-DNM efflux. These results suggest that some naturally occurring compounds found in fruits, vegetables and plants may inhibit P-gp function and can be used as non-toxic chemosensitizers to improve the efficacy of anticancer drugs when administered concomitantly. ;다제내성 (multidrug resistance, MDR)은 인체에서 항암치료가 실패하는 가장 큰 원인 중 하나이며 그 주요한 기전 중 하나로 P-당단백질 (P-glycoprotein, P-gp)의 과다발현을 들 수 있다. P-당단백질은 다양한 종류의 지용성 약물들을 세포 밖으로 배출시키는 역할을 한다. 현재까지 진행된 많은 연구들에 의하면 과일이나 야채, 그리고 한방 치료 식물 등에 항암효과뿐 아니라 P-당단백질 활성을 조절할 수 있는 물질이 존재한다는 결과가 보고되고 있다. 이러한 결과들을 바탕으로, 본 실험에서는 천연 성분들 중에서 P-당단백질의 활성을 억제하여 항암제의 세포 밖으로의 배출을 감소시킬 수 있는 물질을 찾는 것을 그 목적으로 하여, P-당단백질이 과다발현된 유방암 세포인 MCF- 7/ADR 세포에서 실험을 수행하였다. 세포독성 실험을 위해서는 sulforhodamine B (SRB) 염색법을 사용하였고, 0.05μM [³H]-Daunomycin ([³H]-DNM)의 세포 내 축적과 세포 밖으로의 배출 실험은 P-당단백질의 기질이며 저해제인 베라파밀을 양성대조군으로 하고 열 종류의 천연 성분 들을 사용하여 대조군과 비교, 검토하였다. 그 결과, fisetin 을 제외한 모든 물질들이 DNM 의 IC50 값을 유의적으로 감소시켰다. 특히, Biochanin A 는 [³H]-DNM 의 세포내로의 축적을 현저하게 증가시켰으며, quercetin 과 silymarin 은 베라파밀만큼 DNM 의 세포 내 축적을 증가시켰다. 또한, cephalotaxine, morin, 및 naringenin 도 DNM 의 세포 내 축적을 유의성 있게 증가시켰다. 세포 밖으로의 DNM 배출실험 결과는 DNM 축적실험 결과와 상관성이 있었으나, biochanin A, naringenin, 및 silymarin 만이 통계적으로 유의성이 있는 결과을 보여주었다. 또한, 백여 종류의 추출물을 인도네시아의 약용식물에서 추출하여 세포독성 실험을 행한 결과, 20 종류의 추출물들이 P-당단백질의 작용을 억제하였다. Zingiber zerumbet 으로부터 분리된 단일 물질들 중 6 종류의 kaempferol 유도체를 가지고 세포독성 실험과 [³H]-DNM 의 세포 내 축적 및 세포 밖으로의 배출실험을 하였다. 그 결과, kaempferol-3,4',7-６９ O-trimethylether 를 제외한 모든 물질들이 세포독성을 증가시켰으며, 그 중 특히 kamepferol-3-O-methylether 와 kaempferol-3,4'-O-dimethylether 가 양성대조군인 베라파밀과 유사하게 [³H]-DNM 의 세포 내 축적은 증가시키고 세포 밖으로의 배출은 감소시키는 양상을 보여주었다. 이러한 결과들은 과일이나 채소 또는 약용식물에서 발견되는 P- 당단백질 활성을 억제하는 천연 성분들이 항암치료 시 항암제의 효과를 크게 증가시키는 물질들로 사용될 수 있음을 시사한다.