The Osteogenic Induction by Mycophenolic Acid and Far-infrared Irradiation in Human Tonsil-derived Mesenchymal Stem Cells

Abstract

재생 의학에서 중간엽 줄기세포는 골다공증과 같은 골질환 치료에서 골재생을 위한 중요한 재료로 주목받고 있다. 골질환이 발병되면 골수 내 골 조직은 감소하고 지방 조직은 증가하므로, 이 둘 사이의 균형을 유지할 수 있도록 골분화를 증가시키는 것은 골다공증 치료를 위한 이상적인 전략으로 제시된다. 이 연구에서는 주로 면역억제제로 사용되지만 분화를 조절할 수 있는 가능성이 알려진 mycophenolic acid (MPA)와 골분화를 촉진시키고 지방분화를 감소시킨다고 알려진 원적외선을 이용해 편도유래 중간엽 줄기세포의 골형성을 촉진시켜 분화 효율을 높이는 것을 목표로 했다. MPA를 10 μM 농도로 편도유래 줄기세포에 48시간 동안 전처리한 다음 골분화와 지방분화를 각각 유도했을 때, 골분화는 증가하고 지방 분화는 억제되었다. MPA는 IMPDH를 억제하므로, 골분화 촉진에 IMPDH가 역할을 하는지 확인하기 위해 IMPDH를 억제해보았을 때, MPA와 유사하게 편도유래 줄기세포의 골분화를 촉진시키며 칼슘 무기질화를 증가시켰다. 반대로 MPA의 억제 효과를 없애기 위해 100 μM 구아노신을 함께 처리하면 IMPDH 억제 및 골분화 촉진 효과가 모두 역전되었다. 이는 IMPDH 억제로 인한 구아닌 결핍이 MPA가 골분화를 촉진하는 주요한 기전임을 시사한다. 또한, MPA의 IMPDH 억제는 세포 내에서 HDAC3 및 EP300의 단백질 수준을 유의하게 감소시켰으며, 이 또한 구아노신을 처리하면 원래 수준으로 회복되었다. HDAC3 또는 EP300을 억제하면 편도유래 줄기세포의 골분화가 증가했고 HDAC3를 과발현시키면 골분화가 감소했으므로, MPA에 의해 골분화가 촉진되는 기전에는 IMPDH 억제로 인한 구아닌 결핍과 HDAC3, EP300의 감소가 관여한다는 사실을 확인하였다. 다양한 생물학적 효과를 가진 원적외선은 중간엽 줄기세포의 골분화는 촉진시키고 지방분화는 억제시키는 것으로 알려졌으며, 지방 형성 분화와 관련된 억제 메커니즘은 이전 연구에서 보고된 바 있다. 원적외선은 골 조직과 지방 조직 사이의 균형을 유지하기 위한 비침습적인 치료도구로서의 장점을 지니고 있는데, 골형성을 유도하는 기전은 아직 밝혀지지 않았기 때문에 임상에 적용하기 위해서는 메커니즘 확립이 선행되어야 한다. 따라서 본 연구에서는 원적외선이 골분화를 촉진시키는 메커니즘을 조사하였다. 원적외선 조사 후 배양액 유지 시간에 대한 조건을 먼저 확립한 다음, 전사체 분석을 실시하였다. 분석을 통해 원적외선 조사에 의해 증가된 유전자 중 bone morphogenic protein 4 (BMP4)가 여러 샘플의 mRNA를 분석한 결과에서도 일정하게 증가하여 골분화를 촉진시키는 데 관여할 것으로 추측되었다. 단백질 발현량 분석 결과, 원적외선을 조사한 편도유래 줄기세포에서 BMP4 단백질의 안정성이 더 높은 것으로 나타나 단백질 분해의 핵심인 자가포식 과정이 골분화 조절에 관여할 가능성이 있음을 시사했다. 자가포식 관련 인자인 p62 및 LC3-Ⅱ의 발현을 추가로 조사했을 때, 원적외선을 조사한 세포에서 자가포식 관련 단백질이 현저히 감소한 것으로 나타났다. 또한 원적외선은 MPA와 유사하게 HDAC3와 EP300의 발현을 감소시킨다는 사실도 밝혀졌다. HDAC3의 과발현은 이들 단백질의 수준을 크게 증가시켰으며, 이는 모두 HDAC3/EP300/p62 pathway가 원적외선을 매개로 한 골형성 유도를 조절할 수 있음을 시사한다. 세라믹 램프를 이용한 원적외선 조사는 일관된 분화 유도 및 억제 효과를 보이지만, 실제 임상에 적용하기에는 한계점이 존재한다. 따라서 원적외선을 방출할 수 있는 탄소 섬유 시트를 제작하고 골분화 유도능을 테스트했다. 탄소 섬유 시트는 세라믹 램프(500°C 이상)에 비해 훨씬 낮은 온도(60~80°C)에서 원적외선을 안정적으로 방출했다. 60°C 또는 70°C에서 1시간 동안 탄소 섬유 시트에서 방출된 원적외선을 세포에 조사하면 세포 생존력이나 TMSCs의 증식에 영향을 주지 않으면서 유의한 골 형성을 유도할 수 있었다. 이러한 연구 결과는 원적외선을 방출하는 탄소 섬유 시트가 안전한 재료로서 임상에 활용하기에 적합함을 보여주었다. 종합적으로, 본 연구는 MPA와 원적외선 모두 HDAC3와 EP300 억제를 통해 골형성을 유도한다는 것을 입증했으며, 이러한 분자 메커니즘이 골 질환 치료를 위해 골 조직과 지방 조직 간의 균형을 유지하는 데 활용될 수 있음을 제시했다.;In regenerative medicine, mesenchymal stem cells (MSCs) are regarded as crucial components for bone regeneration in the treatment of bone diseases such as osteoporosis. As bone tissue decreases and adipose tissue increases in the bone marrow during the progression of bone diseases, enhancing bone differentiation to maintain a balance between bone and adipose tissue represents an ideal strategy for treating osteoporosis. This study aimed to enhance the osteogenic differentiation efficiency of tonsil-derived mesenchymal stem cells (TMSCs) using mycophenolic acid (MPA) and far-infrared (FIR) emitted from a ceramic lamp and a carbon fiber composite sheet. Pre-treatment of TMSCs with 10 μM MPA for 48 h enhanced osteogenic differentiation but inhibited adipogenic differentiation. The inhibition of inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH), decreasing the total guanine pool, using small interfering RNA (siRNA) mimicked the effect of MPA, enhancing the calcium mineralization of the differentiated TMSCs. The co-treatment with 100 μM guanosine reversed the effect of both MPA and IMPDH inhibition by siRNA, indicating guanine level depletion due to IMPDH inhibition as the primary mechanism of MPA in promoting osteogenesis. MPA as well as IMPDH inhibition significantly decreased the protein levels of histone deacetylase 3 (HDAC3) and histone acetyltransferase p300 (EP300), all of which were recovered with guanosine treatment. The inhibition of HDAC3 or EP300 using their respective siRNAs increased the osteogenic potentials of the TMSCs, and this effect was reversed with guanosine treatment. FIR is another osteogenic inducer investigated in this study. FIR can induce the osteogenic differentiation of TMSCs while inhibiting adipogenic differentiation. Although the mechanisms associated with adipogenic differentiation have been elucidated, the mechanism by which FIR induces osteogenic differentiation remains unknown. To investigate the molecular mode of action mediated by the FIR irradiation on the osteogenesis of the TMSCs, transcriptomic analyses were used to compare the differentially expressed genes between the FIR-irradiated and non-irradiated control TMSCs. Based on the results, several osteogenic factors enhanced by FIR irradiation were selected, and additional investigation of gene expression narrowed down bone morphogenetic protein 4 (BMP4) as a potential candidate related to FIR-mediated osteogenesis. Western blotting analyses observed the higher stability of the BMP4 protein in the FIR-irradiated TMSCs compared to the non-irradiated control at 48 and 72 h post-irradiation, suggesting the potential involvement of autophagy, a key player in protein degradation. Further analysis of transcriptomics data followed by western blotting analyses observed significant reductions in the autophagy-related proteins such as p62/sequestosome 1(SQSTM1) and microtubule associated protein light chain 3 (LC3) after FIR treatment. It was also revealed that FIR downregulated the expression of HDAC3 and EP300, similar to MPA. The suppression of HDAC3 decreased the protein levels of p62/SQSTM1 and LC3-Ⅱ, and the overexpression of HDAC3 dramatically increased the levels of these proteins, all of which indicate that the HDAC3/EP300/p62 autophagy pathway could be responsible for the FIR-mediated induction of osteogenesis. To design more convenient FIR instruments for animal trials and clinical applications, FIR emitted from carbon fiber composite sheet (FIR-CFS) was constructed and tested for its osteogenic potentials. FIR-CFS released FIR at much lower temperatures (60–80°C) compared to a ceramic lamp (exceeding 500°C). Using FIR-CFS at 60 or 70°C for 1 h induced the highest levels of osteogenesis without altering the cell viability or proliferation of TMSCs. These findings demonstrated that FIR-CFS could be used as a more suitable and safe material for clinical applications. This study demonstrated that both MPA and FIR induce osteogenesis through the inhibition of HDAC3 and EP300 levels, indicating that this molecular mechanism can be used to maintain the balance between bone and adipose tissue for the treatment of bone diseases.