Optimization of pro-apoptotic peptide-doxorubicin conjugated prodrug encapsulated liposome for cancer immunotherapy

Abstract

Despite the development of cancer treatment from single chemotherapy to immunotherapy, there are still numerous limitations due to tumor heterogeneity. Among these, drug resistance resulting from survived cancer cells is one of the significant challenges. Thus, multiple combination therapies with chemotherapeutic drugs and drug-resistance inhibitors have been useful in clinical cases. Therefore, we aimed to create a single agent through co-engagement with a prodrug inducing cancer cell-specific apoptosis, enabling efficacy with just one administration. In addition, several concerns about the severe toxicity of chemotherapeutic combinations have been raised. In previous studies, to solve this, FRRG-DOX, which is cleaved by the enzyme cathepsin B, was investigated. However, this drug had the disadvantage of toxicity when administered at high doses. Therefore, we screened peptide precursors to select suitable candidates. Through this, SMAC-FRRL-DOX was selected as an optimized structure with improved drug resistance and reduced toxicity in normal tissues. To enhance the tumor-targeting ability and biocompatibility, we formulated it into PEGylated liposome and experimented with their pharmacological properties. It induced a synergistic effect of chemotherapy and pro-apoptotic activity by being cleaved into SMAC and DOX. Additionally, we confirmed their accumulation in targeting tumor tissue via the enhanced permeability and retention(EPR) effect and their tendency to effectively suppress tumor growth. Particularly, we found that inducing immunogenic cell death(ICD) through the synergistic effect of SMAC and DOX could convert the immunosuppressive tumor microenvironment(ITM) into an immune-responsive environment, thereby enhancing treatment efficacy. Based on the induced ICD, we could enhance the response rate of immune checkpoint blockade (ICB) therapy. Finally, we demonstrated that the combination therapy of anti-PDL1 antibody and SL-Lipo, one of the immune checkpoint inhibitors, resulted in a complete regression rate(CR) of 62.5% and could also prevent tumor recurrence through established memory T cells during treatment. Therefore, this study proposed an immunotherapeutic anticancer agent that can overcome the off-target toxicity and drug resistance of conventional chemotherapeutic agents.;최근 항암치료의 발전에도 불구하고, 종양 이질성으로 인해 여전히 많은 한계가 존재한다. 그 중 대표적인 한계는 약물저항성이다. 특히 선천적인 내성 뿐 아니라, 항암제의 지속적인 투여로 인한 후천적인 약물 내성을 일으킬 수 있으며, 이러한 약물 내성은 기존과 다른 형질의 돌연변이로 인해 재발과 전이로 이어져 환자의 생존율을 크게 저하시킨다. 또한, 약물 저항성은 apoptosis 와 survival signaling에 밀접하게 연관되어 있기 때문에 현재 chemotherapeutic 약물과 drug resistance inhibitor 의 병용 요법이 임상에서 효과적으로 사용되고 있다. 그러나 이러한 병용투여의 심각한 독성에 대한 여러 우려가 제기되고 있는 실정이다. 앞선 연구에서 이를 보완하기 위해 암세포 과발현 효소인 Cathepsin B 에 의해 약물 내성 억제제인 SMAC 펩타이드와 Doxorubicin 으로 분해되는 carrier-free prodrug nanoparticles 로 FRRG-DOX 가 연구되었다. 그러나, 이 약물의 경우, 고용량으로 투여 시의 혈액 내 단백질과 반응하여, 간과 폐에 축적됨으로써, 호흡곤란 증상을 보이다가 즉사하는 문제가 존재한다. 따라서 본 연구에서는 이를 해결하기 위해 약물 내성을 극복하고 정상조직 내 독성을 최소화할 수 있는 암세포 특이적 항암제를 선별하여 이를 리포좀 제형으로 개발함으로써 보다 효과적인 치료법을 제안하고자 한다. 이를 위해 Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAPs) 저해 펩타이드 3 종과 암세포 과발현 효소인 Cathepsin B 에 의해 선택적으로 분해될 수 있는 펩타이드 7 종 조합의 SMAC-XRRX 펩타이드 21 종에 대한 스크리닝을 진행하였다. 이를 통해 SMAC-FRRL-DOX 가 cathepsin B-cleavable prodrug 으로서, 정상 조직에서의 독성을 낮추고, 약물의 저항성 또한 개선된 최적화 구조로 선정되었다. 최종 선정된 SMAC-FRRL-DOX 의 암 표적성 및 생체안정성 향상을 위해 리포좀 제형으로 연구를 진행하였으며, 이들의 약리학적 특성을 확인하였다. 입자의 안정성, 세포내에서의 약물 동태 및 세포 독성을 통해 Cathepsin B 를 과발현하는 암세포에서만 SMAC 과 DOX 로 절단되어 chemotherapy 와 Pro-apoptotic 활성의 시너지 효과를 유도함을 확인하였다. 뿐만 아니라, CT26 대장암 종양이 있는 쥐에서 EPR(enhanced Permeability and Retention) 효과를 통해 표적 종양 조직에 축적되는 것을 확인했으며, 암 성장 또한 free DOX 에 비해 효과적으로 억제하는 경향을 보였다. 특히 면역 분석을 통해 SMAC과 DOX의 시너지 효과로 면역원성 세포사멸(ICD)을 유도함으로써, 면역억제성 종양미세환경(ITM)을 면역반응 환경으로 전환하여 치료 효과를 증진시키는 것을 확인할 수 있었다. 이렇게 유도된 ICD를 바탕으로 면역관문차단(ICB) 치료의 반응률을 향상시킬 수 있었다. 마지막으로 본 연구에서는 면역관문억제제 중 하나인 anti-PDL1항체와 SL-Lipo의 병용 투여를 통해 종양 완전 퇴행율(CR: 62.5%)을 가져왔으며 치료 중 확립된 memory T cell 에 의해 종양 재발을 또한 예방할 수 있음을 증명했다. 따라서 본 연구는 기존 항암제에 대한 약물 내성을 극복하고, 정상 조직 내 독성을 최소화할 수 있는 차세대 면역항암치료제를 제안한다.