Considerations for Mycoplasma Testing Analysis Using Real-Time PCR

Abstract

Mycoplasma, among the smallest bacteria, thrives in artificial media and is often introduced as contamination via personnel, animal-derived raw materials, manufacturing reagents, or facility environments. Mycoplasma testing, conducted to confirm the presence of mycoplasma contamination, includes culture methods (direct culture, enrichment culture, and membrane filtration) and indicator cell culture. For standard culture methods, it takes 28 days to confirm the final results. In this study, a rapid detection method using the real-time PCR technique was performed, comparing the results obtained from two mycoplasma test analysis kits. The test method validation was conducted following the guidelines of the European Pharmacopoeia (EP) 2.6.7 Mycoplasmas and International Council for Harmonisation (ICH) Validation of Analytical Procedures (Q2). Using the widely available A kit and B kit, we established specificity, detection limit, and robustness among the validation parameters. The specificity results confirmed the mycoplasma specificity of both kits, and differences were observed in the detection of gram-positive bacteria related to mycoplasma. Sensitivity was confirmed at 10 CFU/mL and 1 CFU/mL, respectively. Both methods proved to be robustness, as the measured values stayed unaffected by changes in the number of PCR cycles. Moreover, differences in detection were observed based on the real-time PCR primer sequences for gram-positive bacteria related to mycoplasma. Therefore, when selecting standard strains for the validation of mycoplasma testing, it is necessary to consider the frequency of contamination and phylogenetic aspects. By providing insights into the development of real-time PCR methods, this study aims to contribute to obtaining rapid results in mycoplasma testing, assisting in the the manufacturers and researchers conducting mycoplasma testing.;마이코플라스마는 인공배지에서 증식 능력을 가진 가장 작은 세균의 하나로 작업원 및 제조공정 중 사용된 동물 유래 원료·시약 또는 제조 시설·환경에 의해 주로 오염된다. 마이코플라스마의 오염 여부를 확인하기 위해 수행하는 마이코플라스마 부정시험은 배양시험법(직접도말법, 증균배양법, 멤브레인필터법)과 indicator cell culture가 있다. 표준배양법의 경우, 최종결과를 확인하기까지 28일이 소요된다. 본 연구에서는 신속 검출 시험법 real-Time PCR 기법을 가지고 마이코플라스마 부정시험 분석키트 두 가지를 비교 분석하였다. 시험법 검증은 유럽약전 2.6.7. Mycoplasma 공정서 내용 중 ‘Validation of nucleic acid amplification techniques (NAT) for the detection of mycoplasmas: guidelines’ 및 ICH(Q2) ‘Validation of analytical Procedures’ 가이드라인에 따라 수행하였다. 현재 시중에서 널리 사용되고 있는 A kit와 B kit를 사용하여 밸리데이션 항목 중 특이성, 검출한계, 완건성을 설정하였다. 특이성 결과 두 키트의 마이코플라스마의 특이성을 확인하였고 마이코플라스마와 유연관계인 그람 양성 세균 검출에서 차이가 보였다. 각각 민감도 10 CFU/mL, 1 CFU/mL임을 확인하였다. 완건성의 경우 PCR의 주기 변화가 측정값에 영향을 받지 않음으로 확인하였다. 또한, 마이코플라스마 유연균주인 그람 양성 세균의 경우, 마이코플라스마 검출 kit들의 프라이머 시퀀스에 따라 검출 유무에 있어서 차이를 확인할 수 있다. 따라서, 마이코플라스마 부정시험 시험법 검증을 위한 표준균주 선정 시 오염원의 발생 빈도 및 계통학적 관점 등을 고려하는 것이 필요하다. 본 연구를 통해 real-Time PCR법을 개발할 때 고려해야 할 부분을 제공함으로써 마이코플라스마 부정시험을 수행하는 제조사 및 연구자에게 도움이 될 수 있을 것이라고 기대한다.