Protective effects of dehydrocostus lactone against osteolytic bone loss in mice

Abstract

Part I : Excessive osteoclast activity can lead to an imbalance between the synthesis and breakdown of bone, with pathological consequences that include osteoporosis and periodontitis. Thus, controlling osteoclast differentiation and function has significant therapeutic implications. In this study, I investigated the effects of dehydrocostus lactone (DL) on osteoclast differentiation and activation and elucidated the possible mechanisms underlying these processes. DL suppressed osteoclast differentiation by reducing the expression of the nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 (NFATc1). DL attenuated IκBα phosphorylation and p65 nuclear translocation as well as decreased the expression of NF-κB target genes and c-Fos. It also inhibited c-Jun N-terminal kinase (JNK) but not p38 or extracellular signal-regulated kinase (ERK). The reporter assay revealed that DL inhibits NF-κB and AP-1 activation. In addition, DL reduced reactive oxygen species either by scavenging them or by activating Nrf2. The DL inhibition of NFATc1 expression and osteoclast differentiation was less effective in Nrf2-deficient cells. In order to test the therapeutic potential of DL for treating bone diseases caused by excessive osteoclasts, I treated DL on differentiated osteoclasts, DL effectively inhibited their enlargement and resorption activity, and biochemical approaches revealed that DL also attenuates osteoclast activation by inhibiting the migration and lysosome biogenesis and secretion via the down-regulation of integrin β3, protein kinase C β (PKC β) and autophagy related 5 (Atg5) expression. Furthermore, DL prevented bone destruction in inflammation- and ovariectomy-induced osteolytic mouse models. These results indicate that DL has therapeutic potential to treat bone diseases caused by excessive or hyperactive osteoclasts. Part II : Breast cancer is the most common cancer in women. Metastatic breast cancer has spread to various organs, such as bone, lung, brain, and liver, among which bone is the most common metastatic site for breast cancer. When breast cancer metastasizes to the bone, osteolytic metastasis occurs by hyperactivating osteoclasts. Thus, simultaneous control of cancer growth and osteoclast differentiation could be an effective therapeutic strategy to treat osteolytic metastasis. Dehydrocostus lactone (DL) has been known to have anticancer effects by inducing apoptosis of cancer cells and inhibiting cancer cell migration and invasion. I recently reported that DL inhibits osteoclastogenesis by modulating NF-κB and RhoA activity. Thus, I investigated the effect of DL on osteolytic bone destruction induced by metastatic breast cancer cells. DL inhibited the proliferation of 4T1 and MDA-MB-231 breast cancer cells in a dose-dependent manner. DL attenuated AKT and GSK3β phosphorylation, leading to a decrease in β-catenin transcription activity. DL also suppressed breast cancer cell migration and invasion ability along with down-regulation of integrinβ3, FAK, src, and RhoA. Next, I investigated the role of DL in breast cancer-induced osteoclast differentiation. When osteoclast precursor cells were treated with the culture medium of breast cancer cells, DL decreased osteoclast formation and NFATc1 expression. In addition, DL reduced tumor size and prevented bone destruction in breast cancer-induced osteolytic metastasis mouse models. Collectively, these results suggest that DL inhibits cancer growth as well as cancer-induced osteoclast differentiation, thereby ameliorating tumor burden and tumor-induced bone destruction in vivo. Thus, DL might be an effective therapeutic agent for protecting bone metastasis of breast cancer and bone destruction by them. ;우리 몸의 뼈는 인체의 기본골격을 구성하는 매우 중요한 조직으로 뼈의 형성을 담당하는 조골세포와 뼈의 흡수를 담당하는 파골세포에 의해 항상성이 유지된다고 알려져 있다. 노화, 폐경, 염증과 같은 자극에 의해 파골세포가 과도하게 활성화되면 두 세포간의 불균형이 야기되고 그로 인해 뼈의 생성량보다 흡수량이 증가하는 골다공증, 치주염과 같은 질병이 발생하게 된다. 따라서 파골세포의 분화 및 기능을 제어하는 것은 이러한 질병을 치료함에 있어 매우 중요하다고 할 수 있다. Dehydrocostus lactone은 목향에서 추출한 천연물로 항염증, 항암효과를 나타낸다고 알려져 있는 천연물의 일종이다. 그러나 파골세포 분화조절에 대한 DL의 효과는 알려진 바가 없기 때문에 본 연구를 통해 DL의 파골세포 분화 및 기능조절 효과와 관련 메커니즘을 규명하고자 하였다. 먼저, 파골세포 전구체 세포에 MCSF와 RANKL, 그리고 DL을 함께 처리하여 파골세포의 분화를 확인해보았을 때 DL은 NFκB, AP-1, Nrf2 신호전달 경로를 통해 파골세포 분화과정에 중요한 전사인자인 NFATc1의 발현을 조절한다는 것을 확인하였다. DL은 IκBα 의 인산화 및 p65의 핵이동을 억제하여 NFκB의 타겟 유전자인 sod2, il1β, ccl3의 발현을 감소시키고 c-FOS의 발현을 억제하였다. 또한 c-Jun-JNK 신호전달경로를 조절함에 따라 AP-1의 활성 역시 조절함을 확인하였으며, 리포터어세이 분석을 통해 다시한번 DL이 NFκB, AP-1의 활성화를 억제한다는 것을 입증하였다. 이 외에도 DL은 항산화제로 작용하여 H2O2에 의한 활성산소를 직접적으로 저해함과 동시에 Nrf2를 활성화하여 파골세포 분화과정에서 발생하는 활성산소를 감소시켰다. DL에 의한 파골세포 분화 조절이 Nrf2를 매개로 한 활성산소 조절에 의한 것임을 확인하기 위해 Nrf2 KO 마우스를 이용하여 파골세포의 분화를 확인해 본 결과, DL에 의한 NFATc1 발현 및 파골세포의 분화 억제 효과가 Nrf2 KO 마우스의 세포에서 덜 효과적임을 확인하였다. 파골세포 기능조절 능력을 확인해 보기 위하여 분화된 파골세포에 DL을 처리하여 실험을 진행하였다. 그 결과 DL은 Integrinβ3 신호전달경로를 조절하여 파골세포의 이동 및 성숙을 저해하고, PKCβ-TFEB 신호전달경로와 ATG5-LC3 신호전달경로를 통하여 라이소좀의 생합성 및 분비를 억제함으로써 파골세포의 기능을 효과적으로 억제한다는 것을 확인하였다. 마지막으로 염증에 의한 골 손상 마우스 모델과 에스트로겐 결핍에 의한 골 손상 마우스 모델에서 DL의 기능을 확인 한 결과 DL은 두 동물 모델에서 골 침식을 효과적으로 저해함을 확인하였다. 이러한 결과는 DL이 골다공증과 같은 과도한 파골세포 활성화에 의해 발병하는 질환에 효과적인 치료제로 사용될 수 있음을 시사한다. 파트 II 에서는 Dehydrocostus lactone이 유방암의 골 전이에 있어 암의 성장과 파골세포의 활성을 저해하여 유방암에 의한 골 용해성 전이를 억제함을 확인하였다. 유방암은 여성에게 나타나는 가장 흔한 암으로 뼈, 폐, 뇌, 간 등의 장기로 전이가 잘 일어난다고 알려져 있다. 그 중에서도 뼈는 유방암의 가장 흔한 전이부위로 암세포가 뼈로 전이되면 파골세포의 활성을 촉진하여 골 손실이 증가하게 되는데, 이 과정에서 골에 저장되어 있던 TGFβ와 같은 성장인자의 분비가 증가되어 암세포의 성장이 촉진되는 악순환이 형성된다. 따라서 이러한 순환고리를 끊어주는 것이 골 전이암을 치료하는데 있어 매우 중요하다고 할 수 있다. Dehydrocostus lactone은 다수의 선행연구를 통해 암세포의 세포사멸을 유도하고 세포의 이동 및 침윤작용을 억제하는 항암효과과 있음이 밝혀져 있다. 또한 파트 I의 연구를 통해 DL이 NFκB, Integrinβ3-RhoA의 활성을 조절하여 파골세포의 생성을 억제함을 규명하였다. 그러나 DL이 유방암의 뼈 전이로 인한 골 용해과정에서의 조절역할은 밝혀진 바가 없기 때문에 본 연구를 통해 이를 확인해 보고자 하였다. 먼저 DL의 유방암 억제 효과를 확인해보았다. DL은 AKT-GSK3β-β-catenin 신호전달경로를 억제하여 마우스(4T1) 및 사람(MDA-MB-231) 유방암세포의 증식을 효과적으로 억제하였다. 또한 Integrinβ3의 발현을 감소시켜 하위 신호전달경로인 FAK-Src-RhoA 활성화를 저해하고 세포이동에 중요한 세포골격을 무너트림으로써 유방암세포의 이동과 침윤작용을 억제한다는 것을 확인하였다. 유방암에 의한 파골세포 활성화과정에서의 DL의 효과를 확인해보기 위해 파골세포에 유방암세포배양배지를 처리 후 파골세포의 분화를 확인하였을 때, 유방암세포배양배지에 의해 증가된 파골세포의 수와 파골세포 분화에 주요한 전사인자인 NFATc1과 그 타겟 유전자인 CTSK의 발현이 DL에 의해서 감소됨을 확인하였다. 마지막으로 마우스 모델을 통해 DL에 의한 유방암 유발 골 용해성 전이 억제효과를 확인한 결과 DL은 암세포의 성장 및 골 용해를 효과적으로 억제함을 확인하였다. 이러한 결과는 DL이 암세포의 성장 및 파골세포의 분화와 기능을 효과적으로 저해하여 유방암에 의한 골 용해성 전이를 억제하는 새로운 골 전이 치료제로서의 가능성을 제시한다.