Mechanism of cytotoxicity of pharmacological ascorbate (Vitamin C) on human pancreatic cancer cells

Abstract

아스코르브산(비타민 C)은 독성 자유 라디칼에 의한 산화적 손상을 방지하기 위한 필수 생체 분자로 콜라겐 합성 및 기타 많은 세포 사건에 관여한다. 최근 고용량의 아스코르브산 투여가 KRAS 우성 돌연변이를 갖고 있는 암세포를 죽이는 데 효과적이라고 보고되었다. 암세포를 사멸시키는 약리학적 아스코르브산의 주요한 메커니즘은 아스코르브산과 디하이드로아스코르브산의 산화 환원 순환에 의한 세포 산화 스트레스라고 제안된다. 췌장암은 초기 진단이 쉽지 않고5년 생존율이 10% 미만일 정도로 예후가 좋지 않은 암 중 하나이다. 췌장암의 경우, KRAS 돌연변이가 90% 이상 발생하기 때문에 아스코르브산의 항암 효과와 췌장암 세포 종류 별 KRAS 돌연변이 패턴의 관계에 초점을 맞춰서 연구를 진행하였다. 본 연구에서는 8가지 종류의 췌장암 세포주 (AsPC-1, PANC-1, Capan-2, Mia PaCa-2, BxPC-3, SNU213, SNU324, SNU41)와 췌장 정상 세포주(H6c7)에서 세포 생존력 실험을 통해 아스코르브산에 대한 세포 생존율 및 독성 효과를 측정하였다. 그 결과, 아스코르브산은 야생형(Wild-type) KRAS를 가진 SNU324 세포를 포함하여 모든 췌장암 세포에 특이적으로 세포 사멸을 유도했다. 또한, 아스코르브산 농도에 따른 세포질 과산화수소 (H2O2) 생성량과 미토콘드리아 과산화수소 (H2O2) 생성량을 과산화수소 (H2O2) 특이적 형광 프로브를 사용하여 비교하였다. 그 결과, 세포질 과산화수소 (H2O2) 생성과 미토콘드리아 과산화수소 (H2O2) 생성 수준은 유사한 패턴을 보이지 않았으며, 전체 췌장암 세포들 중 MIA PaCa-2 세포에서 아스코르브산에 의해 발생하는 미토콘드리아 과산화수소 (H2O2) 생성 수준이 가장 높았다. 또한, 고용량 아스코르브산의 세포독성 효과와 과산화수소 (H2O2) 생성 수준이 항상 비례하지는 않았다. 다음으로, 췌장암 세포주 및 정상 세포에서 아스코르브산 질량 분석 실험을 진행하였고, KRAS 돌연변이를 가진 대부분의 췌장암 세포에서 아스코르브산 흡수양이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 이전 연구들과 비슷하게 아스코르브산의 흡수가 KRAS 돌연변이의 존재와 관련이 있음을 보여준다. 다음으로, 유세포 분석 실험을 통해 일부 췌장암 세포에서 초기 세포자멸사(apoptosis)의 비율이 매우 낮았음에도 불구하고 말기 세포자멸사(apoptosis)의 비율이 극도로 높은 것을 확인하였으며 라이브 세포 영상 결과를 통해 고용량 아스코르브산에 의한 세포 사멸이 바로 옆에 인접해 있는 다른 세포로 전이되는 현상을 관찰하였다. 이 결과들을 통해, 이전에 알려졌던 세포 내 아스코르브산과 탈수소 아스코르브산의 산화 환원 순환에 의한 세포 산화 스트레스 메커니즘 뿐만 아니라, 일부 췌장암 세포에서 고용량 아스코르브산을 통한 새로운 세포 사망 메커니즘의 가능성을 제시한다. ;L-Ascorbate (Vitamin C) is an essential biomolecule for preventing the cell from oxidative damage caused by toxic free radicals and is implicated in many cellular events such as collagen synthesis and hydroxylation reactions. Recently, it has been reported that high-dose ascorbate by intravenous injection effectively kills cancer cells containing KRAS dominant mutation. Major cytotoxic effects of pharmacological ascorbate on cancer cells are proposed to be cellular oxidative stress by the redox cycle of ascorbate and dehydroascorbate. Pancreatic cancer is not easy to detect at the early stage, and it has a poor prognosis, with a 5-year survival rate of less than 10%. Since pancreatic cancer has more than 90% KRAS mutation, we studied the mechanism of pharmacological ascorbate on human pancreatic cancer cells. In this study, cell viability was measured by MTT colorimetric assay and ATPlite luminescence assay in a human pancreatic normal cell line (H6c7) and human pancreatic cancer cell lines including AsPC-1, PANC-1, Capan-2, MIA PaCa-2, BxPC-3, SNU213, SNU324 and SNU410 in the presence of ascorbate. In these results, ascorbate specifically induced cell death in all pancreatic cancer cell lines, including SNU324 which has wild-type KRAS. The amount of cytosol and mitochondrial H2O2 generation was measured using H2O2-specific fluorescent probes in human pancreatic cell lines according to the ascorbate concentrations. The amount of cytosol H2O2 generation and mitochondrial H2O2 generation did not show similar patterns. Mitochondrial H2O2 level in MIA PaCa-2 was highest among pancreatic cancer cell lines in the presence of high-dose ascorbate. The cytotoxic effect of high dose ascorbate and the amount of H2O2 generation level were not always proportional. The amount of ascorbate uptake was measured by mass spectrometry in human pancreatic cells. This result showed that the amount of ascorbate uptake increased in most pancreatic cancer cells harboring KRAS mutation. We detected apoptosis using flow cytometry and observed cell death patterns by incucyte live-cell imaging system. In some pancreatic cancer cells, the proportion of late apoptosis was extremely high, even though the proportion of early apoptosis was very low. In MIA PaCa-2 live-cell imaging results, cell death by high-dose ascorbate spread to another cell next to it. These results suggest the possibility that a new cytotoxicity mechanism of pharmacological ascorbate exists in addition to a previous mechanism of cellular oxidative stress by the redox cycle of ascorbate and dehydroascorbate in the cell.