Mitochondrial TRAP1 Inhibition and Mitochondrial Homeostasis Regulation via Cav1.3 Calcium Channel Blocking

Abstract

Part Ⅰ. Design and Synthesis of Selective TRAP1 Inhibitors. Hsp90 (Heat Shock Protein 90) is one of the most abundant molecular chaperones in eukaryotic cells that related to the cytoprotecting folding, stabilization, and activation of a target protein called "client protein”. TRAP1 (TNF receptor-associated protein1), a member of the Hsp90 chaperone family, is found predominantly in mitochondria. According to previous studies, TRAP1 is considered an effective anticancer agent because it is overexpressed in cancer conditions. However, since Hsp90 and TRAP1 are structurally similar, it is difficult to make a drug that selectively inhibits TRAP1. Herein, I found the structural differences between Hsp90 and TRAP1 using computational chemistry program. Based on protein structure, the benzyl ring part was synthesized symmetrically from original purine scaffold. As a result, 2-amino-9-(4-bromo-2,6- dimethylbenzyl)-6-chloro-7,9-dihydro-8H-purin-8-one (7) is the most selective TRAP1 inhibitor over Hsp90. Additionally, various TPP derivatives linked ester group were synthesized to increase the selectivity, permeability and anticancer effect of mitochondria. These derivatives act as prodrugs and are expected to be effectively accumulate inside mitochondria.

Part Ⅱ. Synthesis of Delocalized Lipophilic Cation Conjugated TRAP1 Inhibitor Hsp90 (Heat Shock Protein 90) is one of the most abundant molecular chaperones in eukaryotic cells that related to the cytoprotecting, folding, stabilization, and activation of a target protein called “client protein” More specifically, Hsp90 consists of four types of paralog; Hsp90α, Hsp90β, GRP94 and TRAP1. Hsp90α and Hsp90β are present in the cytoplasm, GRP94 is present in the ER (endoplasmic reticulum), and TRAP1 (TNF receptor-associated protein1) is in the mitochondria. Therefore, in order to make a drug that selectively inhibits TRAP1, it is necessary to synthesize the drug that considered to improve mitochondrial permeability. TPP(Triphenylphosphine) is, a delocalized lipophilic cation, a moiety that is often used as a strategy to improve mitochondrial permeability. I am trying to study how the anticancer effect changes when there are various substituted functional group into the TPP. In this study, we compared the results of changes in the positive charge of phosphonium and the three-dimensional structure of DLC.

Part Ⅲ. Development of CaV1.3 Calcium Channel Blocker for Parkinson’s Disease Parkinson's disease (PD) is commonly known to occur when dopaminergic neurons die in the brain's SNc (substantia nigra compacta). There have been various attempts to treat this disease in previous studies. DHP (dihydropyridine)- type drugs such as ‘isradipine’ have been developed, but there are big hurdles that this causes cardiotoxicity. Recent studies have shown that CaV1.3 is expressed in an aging-dependently causes Parkinson's disease by raising mitochondrial oxidative stress. Therefore, it is noted that blocking the CaV1.3 selective calcium channel is currently one of the most effective attempts to treat PD. In this study, I designed a DHP - derivative drugs, especially by linking a long aliphatic chain to one of methyl ester part of DHP so that it expected to effectively bound to the calcium channel of plasma phospholipid - binding position. Furthermore, based on the research results that PYT shares a binding site with DHP, I synthesized PYT (pyrimidine2,4,6-trione), and HPYT (hybrid pyrimidine-2,4,6-trione) derivatives by introducing various aromatic groups into 1,3-diketone of PYT. Also, I am currently studying to optimizing reaction using a specific palladium catalyst for this HPYT synthesis (see Part Ⅳ).

Part Ⅳ. Palladium Catalyzed Aromatic Ring Insertion into 1,3- diketones We previously identified in Part Ⅲ, PYT (1, Barbiturate, pyrimidine-2,4,6-triones) of the calcium channel blocker derivatives. It is presumed that performing aryl insertion using a palladium catalyst is more efficient and economical than using methods such as the existing malonate reaction, Michael addition reaction, and Knoevenagel condensation reaction. Here in, we studied for further reaction optimization of hybrid pyrimidine-2,4,6-triones (HPYTs) forming from barbiturate (PYT). Finally, by screening for various catalysts, ligands, bases and solvents, we were able to optimize the standard reaction. ;Part Ⅰ. Design and Synthesis of Selective TRAP1 Inhibitors. Hsp90(Heat shock protein 90)은 클라이언트 단백질의 안정화와 접힘에 관여 하는 진핵세포에서 가장 풍부한 분자 샤페론 중 하나이다. TRAP1(TNF receptor associated protein1)은 Hsp90의 isoform 중 하나로, 주로 미토콘드리아에서 발 견된다. 이전 연구에 따르면 TRAP1은 암상태에서 과발현되기 때문에 효과적인 항암 타겟으로 간주된다. 그러나 Hsp90와 TRAP1의 구조적인 유사성 때문에 TRAP1선택적인 저해제를 개발하여야 하며, TRAP1이 미토콘드리아 내부에 존재 하기 때문에 투과성을 고려하여 약물이 설계 되어져야 한다. 본 연구에서는 구조기반 분자모델링을 통하여 기존의 화합물보다 선택성을 100배 이상 높인, 2-amino-9-(4-bromo-2,6-dimethylbenzyl)-6- chloro-7,9-dihydro-8H-purin-8-one(7)을 합성해 내었으며, 약물 효과 를 높이기 위해 TPP(Triphenylphosphine)을ester linker로 연결한 다양한 화합물들을 합성하여 약효를 보고자 하였다.

Part Ⅱ. Synthesis of Delocalized Lipophilic Cation Conjugated TRAP1 Inhibitor Hsp90 은 Hsp90α, Hsp90β, GRP94 그리고 TRAP1 의 4 가지 유형 isoform 으로 존재한다. Hsp90α와 Hsp90β는 세포질에 존재하며, GRP94 는 소포체에 존재하고, TRAP1 은 미토콘드리아 내부에 존재한다. 미토콘드리아와 관련된 질병들은 무수히 많지만, 현재까지 미토콘드리아 내부를 타겟으로 하는 약물의 개발은 전무후무하다. 미토콘드리아에 대한 투과도를 조절하기 위하여 DLC(Delocalized lipophilic cation)의 전략으로써 TPP (triphenylphosphine)을 주로 사용한 방법은 잘 알려져 있지만 이 화합물이 과연 가장 최적화된 화합물인지에 대한 연구는 진행된 바 없다. 본 연구에서는 TPP 를 최적화하기 위해 다양한 치환기를 도입해 phosphonium 양전하의 변화와 3 차원 구조의 변화에 따른 실험 결과를 비교하였고, 그 결과 선택성과 항암결과가 뛰어난 화합물 (6-(2-Amino-6- chloro-9-(3,4-dichlorobenzyl)-8-oxo-8,9-dihydro-7H-purin-7- yl)hexyl)trioctylphosphonium (12h)을 합성해 낼 수 있었다.

Part Ⅲ. Development of CaV1.3 Calcium Channel Blocker for Parkinson’s Disease 파킨슨병은 중뇌의 SNc(substantia nigra compacta)에서 도파민성 뉴런이 사멸될 때 발생하는 것으로 알려져 있다. 최신 논문에 따르면 CaV1.3(calcium channel 1.3)은 노화 의존적으로 미토콘드리아의 산화적 스트레스를 증가시켜 파킨슨병을 유발하는 것으로 나타났다. 증가된 산화적 스트레스는 DJ-1, PARK7 과 같은 유전자를 손상시켜, 도파민뉴런의 세포죽음을 유발한다. 따라서 CaV1.3 선택적으로 칼슘 채널을 차단하는 것은 현재로써는 파킨슨병을 치료할 수 있는 가장 유망한 방법임에 주목하게 된다. 칼슘 채널을 차단하기 위한 대표적인 DHP계열 약물인 isradipine은BBB(Blood Brain Barrier)를 통과할 수 있는 약물이지만 선택성이 없기 때문에 심장독성을 유발한다는 한계점이 있다. 따라서 CaV1.3 에 선택적인 약물을 합성하기 위하여 다양한 DHP 유도체를 합성하며 SAR(structure activity relationship)연구를 진행했다. 특히, 칼슘 채널이 막단백질이라는 점에 유의하여 DHP 구조의 한쪽 methyl ester 부분을 다양한 길이의 지방족 사슬로 연결시킨 방향족을 도입해 막의 인지질 이중층에 잘 결합하도록 구조를 변화시켰다. 뿐만 아니라, DHP 와 바인딩사이트를 공유하는 것으로 알려진 PYT (pyrimidine-2,4,6- trione)화합물 유도체와, PYT 에 방향족 화합물을 도입한 HPYT(hybrid PYT)또한 합성하여 결과를 관찰하였다.

Part Ⅳ. Palladium Catalyzed Aromatic Ring Insertion into 1,3- diketones 이전 연구에서 칼슘채널 차단제 유도체인 HPYT 를 합성함에 있어서, 기존에는 malonate 를 이용하여 방향족 화합물을 도입한 후 cyclization 하는 방법으로 합성을 진행했었다. 하지만 방향족 화합물의 치환기를 다양하게 바꾸어 가며 구조변화활성을 관찰하기에는 시간적인 효율성과 경제성이 떨어지기 때문에 팔라듐 촉매를 사용하여 방향족 화합물을 1,3-diketone 에 도입하는 방법 개발이 시도되어졌다. 기존의 oxindole 과 같은 2 차원적인 구조에서의 방향족 도입 방법은 연구되었지만, 3차원구조에서의 팔라듐 촉매를 이용한 방향족 도입 방법은 연구된 바 없다. 따라서 본 연구에서는, 다양한 촉매, 리간드, 염기 및 용매를 스크리닝 하여 표준 반응을 최적화하였고, 반응 메커니즘을 규명하여 입체장애로 인한 위치선택성 또한 밝혀낼 수 있었다.