Development of pancreatic cancer targeting aptamer and therapeutic application

Abstract

Pancreatic cancer is the most lethal malignant tumor, with a complex etiology and highly aggressive nature. The extremely poor 5-year survival rate of less than 5~9% is due to the absence of a reliable early detection marker and severe resistance to therapeutics. Novel efficient therapeutics incorporating new strategies are needed for targeting pancreatic cancer. This thesis explores the potential of aptamers for this purpose. Aptamers are short sequences of single strand oligonucleotides with many advantages in drug development including high specificity and affinity to targets, recognition of the unique three-dimensional structure of the target, avid penetration into tumor tissue, and time- and cost-effectiveness based on systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) screening and easy synthesis. In PART I of this thesis, I document the generation of a pancreatic cancer-targeting DNA aptamer through a cell-based SELEX method that is processed in living cells and recognizes the natural conformation of targets. Aptamer SQ7 (80 nt) was selected from an enriched aptamer pool at the fifth round of the SELEX process. The 32-nt SQ7-1 aptamer was derived from SQ7 by size optimization. SQ7-1 displayed equal binding ability to pancreatic cancer cells in a mouse xenograft model and a pancreatic cancer cell line. Moreover, SQ7-1 showed a strong ability to target pancreatic cancer in patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) models. In PART II of this thesis, I document the development process of SQ7-1 aptamer-based therapeutics combining stability and efficacy. I adopted the strategy of Drug-Aptamer-Antibody conjugation, in which the aptamer kills tumor cells, targets tumor cell navigators, and is stably delivered, respectively. The aptamer-antibody complex (Oligobody) composed of cotinine conjugated SQ7-1 and anti-cotinine antibody enhanced the half-life of Cot-SQ7-1 Oligobody to 8.5 hr (T1/2=8.5 hr) without loss of binding affinity and specificity. Furthermore, monomethyl auristatin E (MMAE) drug-conjugated Oligobody (DOligobody) significantly suppressed tumor growth with no liver and renal toxicity in an in vivo pancreatic cancer mouse model. The collective findings reinforce the plausibility of the novel Drug-Aptamer-Antibody concept based on the cancer-specific targeting, serum stability, and antitumor efficacy by the SQ7-1 aptamer satisfied with cancer-specific targeting. With further optimization, SQ7-1 aptamer-based therapeutics might be successfully applied as a new treatment for pancreatic cancer.;췌장암은 5년 생존율이 5~9% 미만으로 주요 암 종 중에서 가장 낮은 생존율을 보이는 치명적인 암이다. 췌장암은 조기진단을 위한 생물학적 표지자나 영상학적 검사가 없기 때문에 대부분의 경우는 수술이 어려운 진행성 또는 전이성 췌장암으로 진단되며, 췌장암 치료 역시 표준 항암약물치료제로서 Gemcitabine 외에 생존율을 증가시키는 약제가 없어, 그 예후를 더욱 불량하게 만든다. 따라서 새로운 전략의 췌장암 치료제 개발의 필요성이 절실함을 의미한다. 한편, 압타머는 짧은 단일 가닥의 핵산으로서, 표적분자의 삼차원 구조를 인식하여 높은 표적능을 갖으며, 종양조직으로 투과에 용이하다. 또한 시험관 내 SELEX 과정을 통해 발굴되어 시간과 경제적인 측면에서 유리하며, 쉽게 합성할 수 있다는 이점을 가진다. 이 논문의 1 부에서는 세포를 기반으로 한 SELEX (Cell-SELEX)방법을 통해 췌장암 세포 특이적 DNA 압타머의 개발 및 특성 규명에 관한 연구를 수행하였다. 췌장암 세포를 대상으로 한 Cell-SELEX을 통해 췌장암세포 표적능을 가진 SQ7 (80 nt) 압타머를 선별하였고, 2차구조 예상 모델을 기반으로 하여, 32 nt로 서열 길이를 최적화하였다. 또한 최적화된 압타머(SQ7-1, 32 nt)는 췌장암 세포주 및 이종 이식 마우스 뿐만 아니라 환자-유래 이종이식모델에서도 높은 친화성과 표적성을 나타내었다. 이 논문의 2부에서는 최적화된 압타머 SQ7-1을 기반으로 하여 췌장암 치료제로서의 개발을 위한 최적화에 대해 다루었다. 약물-압타머-항체 결합체 전략을 수립하여, 안정성과 항암 효능을 증가시켰다. 먼저, 압타머에 항체가 결합된 형태, 즉 올리고바디(Oligobody) 컨셉을 도입하여, 생체내 반감기가 8.5 시간으로 증가됨을 확인하였다. 또한 항암효능을 증진시키기 위하여, 약물이 결합된 형태의 올리고바디, 즉, 돌리고바디(DOligobody)를 개발하였고, 이는 간과 신장 독성이 없으면서 종양 성장 억제효과가 있음을 입증하였다. 종합적으로, 본 연구에서는 개발한 췌장암 특이적 압타머 SQ7-1는 약물과 항체 결합체를 이루어 DOligobody의 형태로 안정적이고, 효과적인 췌장암 표적 치료제로서의 가능성을 확인하였다. 본 치료제 후보는 압타머 SQ7-1에 의해 선택적으로 결합된 췌장암 세포에서만 약효를 낼 수 있도록 설계되어 있으므로, 안정성과 암세포 살상 효능이 겸비된 새로운 전략의 치료제로서 성공적으로 개발되어 임상에 적용될 수 있기를 바란다.