Novel Inhibitors of Oxidative Phosphorylation in Mitochondria as Anti-cancer Drug Candidates based on NMac analogues

Abstract

Recent studies have shown that mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) can be an attractive target of anti-cancer therapeutics in addition to Warburg effect, because OXPHOS is upregulated in various cancers. This study found that small molecule Nm23/Nucleoside diphosphate kinase (NDPK) activators (NMacs) induce mitochondrial dysfunction via OXPHOS inhibition under glucose starvation, not under normal condition. NMac1 is an inhibitor of triple-negative breast cancer metastasis by activating metastasis suppressor protein Nm23-H1/NDPK-A. For the functional studies, various NMac1 analogue compounds were designed and synthesized in collaboration with KAIST, and were tested the inhibitory activity of mitochondrial functions, i.e., ATP synthesis, AMPK signaling pathway, cellular oxygen consumption rate (OCR), mitochondrial membrane potential (MMP). Further studies for OXPHOS inhibition were performed employing selected novel compounds. The effect of the compounds in inhibiting either cancer metastasis or proliferation were screened and thus, were grouped into five families. Among these, this study focused in Family I, compounds having activities for both Nm23-H1/NDPK activation and OXPHOS inhibition and Family II, compounds having only OXPHOS inhibition activity as they both have anti-proliferation activity. To investigate how they act in cancer proliferation, further studies were performed with the representative compound of each family. NMacs inhibiting OXPHOS induce elevation of mitochondrial ROS level as well as the decrease of OCR, ATP synthesis and MMP. In order to investigate how NMacs induce mitochondrial dysfunction under the glucose-depleted condition, metabolomics have been done to examine the metabolic changes in response to glucose depletion and NMac1 treatment. It turns out that TCA cycle was inhibited by NMac1 only when the glucose is depleted, although the mitochondrial target of NMac1 was not identified. These NMac analogues provide possibilities as cancer therapeutics by examining the effect of inhibiting tumor growth in in vitro three-dimensional (3D) tumor invasion assay of breast cancer cells. The results demonstrate that NMac analogues can be novel cancer therapeutics by inhibiting cancer proliferation as well as cancer metastasis via mitochondrial OXPHOS inhibition. Further studies are required to identify a specific mitochondrial target of the compounds and to understand the mode of action as inhibitors of both cancer metastasis and proliferation.;Nucleoside diphosphate kinase (NDPK, Nm23)는 NTP 말단의 phosphate를 NDP로 전달하는 활성을 가지는 효소이다. 사람에서는 현재까지 10가지 subtype (Nm23-H1 to Nm23-H10) 의 Nm23가 발견되었으며 그 중에서도 Nm23-H1과 Nm23–H2는 유방암과 폐암을 포함하여 다양한 암 종에서 암 전이를 저해하는 단백질로 잘 알려져 있다. 이전 연구에서는 세포 내에서 Nm23-H1의 NDPK 효소 활성이 산화-환원 기전에 의해 조절 된다는 것을 밝혔고 Nm23-H1의 NDPK 활성이 암전이 저해 활성에 중요한 역할을 함을 확인하였다. 이러한 사실을 바탕으로 천연물 라이브러리 중에서 Nm23-H1의 NDP Kinase 활성을 증가 시키고, 결과적으로 암 전이를 저해하는 효과를 가진 화합물인 NMac1이 선별되었다. NMac1은 생체 외 실험에서 암세포의 침습 능력을 감소시켰으며, 생체 내 실험에서 원발 종양의 크기에는 영향을 주지 않으면서 암 전이를 감소시켰다. 또한 NMac1 의 구조-활성 관계를 파악하여 활성에 핵심적인 역할을 하는 작용기를 찾고, 이를 중심으로 다양한 유도체 물질들을 합성하였다. 이전 연구를 통해서는 NMac1 의 암 전이 억제 활성에 대해 밝혔다면, 이번 연구에서는 NMac1이 포도당이 없는 환경에서만 특이적으로 triple-negative breast cancer (TNBC) 세포인 MDA-MB-231의 증식을 저해하는 활성에 대해 밝혔다. 이러한 활성은 전이를 억제하는 활성과는 달리, 산화적 인산화 과정을 억제하여 미토콘드리아 기능을 저해한다는 것을 다양한 생체 외 실험을 통해 증명하였다. 또한 NMac1의 암세포 성장 저해는 Nm23-H1 또는 –H2의 활성화에 의한 현상이 아님을 밝혔다. MDA-MB-231 세포 주에서 NMac1은 포도당이 없는 환경에서 특이적으로 AMPK/mTOR/ERK 신호전달 경로의 변화를 초래하고 그 결과, 세포 내 ATP고갈과 함께 미토콘드리아 기능을 상실 시키며 최종적으로 세포의 증식을 감소시켰다. 추가적으로 현재까지 76개의 새롭게 합성된 NMac1 유도체를 이용하여 전이 억제 및 증식 억제 활성을 조사하였고 각각의 활성 유무에 따라 5가지 과로 분류하였다. 특히 동일한 농도에서 더 효과적인 증식 억제 활성을 갖는 새로운 화합물인 HYL-NM-024를 찾는 성과를 이룰 수 있었다. HYL-NM-024는 완전히 새롭게 합성되어 얻어진 물질로서, NMac1 에 비해 모든 생체 외 실험에서 강력한 효과를 보이는 한편, 더 낮은 분배계수 (Partition coefficient) 를 가지기 때문에 새로운 약물 후보물질로 긍정적으로 보여진다. 본 연구는 추가적인 유방암 세포 주인 MCF7과 폐암 세포 주인 H157, A549 등을 이용하여NMac1 의 효과가 세포 주에 따라 차이를 보인다는 것도 확인 하였다. 암세포는 빠른 증식을 위해 호기성 해당작용을 통한 대사 변환을 일으키고 이를 통해 포도당을 빠르게 소비한다고 알려져 있다. 이에 따라 암세포 내의 포도당 농도는 일반 세포보다 낮은 것이 특징적이다. 또한 미토콘드리아는 대부분의 ATP를 생성하고 암세포가 성장하는 데에 중요한 역할을 한다. 최근 들어 호기성 대사작용뿐만 아니라 유방암과 폐암세포를 포함한 특정 암세포에서 미토콘드리아의 산화적 인산화 역시 항진되어 있다는 사실이 밝혀지면서 산화적 인산화를 억제할 수 있는 물질들이 새로운 암 치료제로서의 가능성을 인정받고 있는 추세이다. 따라서, 우리는 잘 알려진 산화적 인산화 억제 약물과 증식 억제 활성을 비교하여 NMac1, HYL-NM-024가 보다 효과적임을 증명하였다. 이러한 결과들은 NMac1이 기존의 암전이 효과와 더불어 정상세포가 아닌 암세포 환경에서만 미토콘드리아의 기능장애를 일으키는 기전을 가진 증식 억제 물질로서의 가능성을 보여준다. 더불어 이번 연구에서 생체 내 조건과 보다 유사한 환경인 3차원적 세포 배양 방법을 이용해 NMac1과 유도체들의 효과를 확인하였다. 이는 추후 NMac1과 유도체들이 항암 치료의 후보 화합물로서 긍정적으로 검토될 수 있는 근거가 된다.