The effect of reprogrammed cancer-associated fibroblasts by miR-224 on the migration and invasion of lung cancer cells

Abstract

Lung cancer is one of the most frequently diagnosed cancer and is the primary cause of cancer death. Especially, non-small cell lung cancer (NSCLC) including lung adenocarcinoma (LUAD) has been frequently diagnosed in Korea since 2011. Metastasis is the major reason of the continued increase in lung cancer-related death. This metastasis proceeds with various factors including epithelial-mesenchymal transition (EMT) as well as tumor-supportive microenvironment. Among them, cancer-associated fibroblasts (CAFs) are one of the major elements that contributes to build tumor-supportive niche. This CAFs can be activated by many factors such as growth factors, cytokines, and microRNAs (miRNAs). In this research, the roles of miR-224 which can trigger activation of CAFs were identified, and its effects on invasion and metastasis of lung cancer were investigated. To investigate miRNAs that contribute to the reprogramming of normal lung fibroblasts (LFs) into CAFs, global miRNAs expression was profiled in LFs and CAFs via the Nanostring nCounter method. Among the identified miRNAs, miR-224 exhibited elevated expression in CAFs and its expression was also higher in lung tumors than in normal tissues in dbDEMC (a database of differentially expressed miRNAs in human cancers) and TCGA (the cancer genome atlas) data. In addition, miR-224 levels were measured through qRT-PCR in paraffine-embedded tumor samples from patients with LUAD. High expression of miR-224 was associated with poor survival of patients with LUAD in Kaplan-Meier analysis. The overexpressed miR-224 heightened the overall expression of CAF activation markers. LFs overexpressing miR-224 promoted the migration and invasion of lung cancer cells through direct cell-to-cell contact in co-culture systems. In a mouse orthotopic injection model, the overexpression of miR-224 in LFs increased metastasis of lung cancer cells. Through prediction tools for miRNA targets, target genes of miR-224 were selected and, Akirin1 was validated as a direct target gene of miR-224 by 3’-UTR luciferase assay. To verify the effect of Akirin1 on lung cancer cells, LFs were transfected with Akirin1 siRNAs. Consequently, Akirin1 knockdown in LFs stimulated the migration and invasion of lung cancer cells in co-culture systems. Interestingly, miR-224 suppressed migration and lamellipodia formation of LFs by modulating cell attachment. Taken together, miR-224 induces the activation of CAFs, promoting the migration and invasion of lung cancer cells by targeting Akirin1 in co-culture systems. ;폐암은 흔히 진단되는 암종의 하나이며, 특히 폐선암을 비롯한 비소세포폐암은 2011년 이래로 한국에서 가장 자주 진단되는 암종이다. 이러한 폐암의 전이는 폐암과 관련된 사망의 주된 원인으로, EMT와 같은 다양한 과정을 통한 암 친화적인 환경에서 진행된다. 그중에서 CAF는 암 진행 및 전이가 잘 일어날 수 있는 환경을 구성하는 주요한 요소 중 하나이다. 이러한 CAF는 성장 인자, cytokine 또는 microRNA에 의해 활성화된다. 본 연구에서는, CAF 활성화를 유도하는 miR-224의 역할을 규명하고, 그로 인해 폐암의 침윤과 전이에 미치는 효과를 연구하였다. 정상 폐섬유아세포(LF)를 CAF로 활성화시키는 miRNA를 찾기 위해, Nanostring nCounter를 통해 LF와 CAF에서 miRNA 발현을 확인하였다. miR-224는 CAF에서 발현이 높았고, dbDEMC와 TCGA data를 통해 정상 조직보다 폐암 조직에서 발현이 더 높은 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 환자의 폐암 조직에서 qRT-PCR을 통해 miR-224의 발현을 측정하였고, Kaplan-Meier 분석을 통해 miR-224의 발현이 높은 폐암 환자의 예후가 좋지 않은 것을 확인하였다. miR-224의 기능을 확인하기 위해 LF에서 miR-224를 과발현시켰고, 그 결과 CAF 활성화 마커의 발현이 전반적으로 증가하였다. 이러한 miR-224 과발현 LF는 폐암세포와 함께 직접적인 공동배양을 했을 때 폐암세포의 이동과 침윤을 증가시켰다. 뿐만 아니라, mouse orthotopic injection 모델에서 miR-224 과발현 LF가 폐암세포의 전이를 촉진하였다. miR-224의 타겟 유전자를 찾기 위해, RNA sequencing과 타겟 예측 프로그램을 이용하여 Akirin1 유전자를 찾았고, 3’-UTR luciferase assay를 통해 miR-224의 직접적인 타겟임을 확인하였다. Akirin1의 기능을 확인하기 위해, LF에 siRNA를 사용하여 Akirin1을 억제시켰다. 그 결과, 공동배양 시스템에서 폐암세포의 이동과 침윤이 증가하였다. 흥미롭게도, miR-224는 cell attachment 조절을 통해 LF의 이동과 lamellipodia 형성을 억제시켰다. 결론적으로, miR-224는 CAF를 활성화하고, CAF와의 공동배양 시스템에서 Akirin1을 조절하여 폐암세포의 이동과 침윤을 촉진시키는데 중요한 역할을 한다.