WISP-1 secretion from cancer-associated fibroblasts exposed to apoptotic cancer cells inhibits lung cancer cell proliferation via STAT1

Abstract

Interaction between the tumor microenvironment (TME) and apoptotic cancer cells regulates cancer progression, growth, and metastasis. In the present study, it was investigated whether and how conditioned medium (CM) from cancer-associated fibroblasts (CAFs) exposed to apoptotic cancer cells inhibits the proliferation of lung cancer cells. Cell viability (CCK-8 test), qRT-PCR, western blot, and colony formation assay were performed in lung cancer cells to measure cell proliferation. CM from lung CAFs exposed to apoptotic 344SQ (ApoSQ-CAF CM) and A549 cells (ApoA-CAF CM) suppressed proliferation of lung cancer cells based on cell viability, mRNA and protein expression levels of cell proliferation markers, and colony formation assays. Immunofluorescence staining showed that phosphorylated-STAT1 and p21 were enhanced by treatment with ApoSQ-CAF CM. siRNA-mediated STAT1 silencing or pharmacologic inhibition of STAT1 activation in lung cancer cells reversed the anti-proliferative effects. However, treatment with ApoSQ-CAF CM into STAT1-overexpressed 344SQ cells further enhanced the anti-proliferative effects. It was also demonstrated that inhibition of Notch1-Wnt-induced secreted protein 1 (WISP-1) signaling pathway in CAFs by siNotch1, Notch1 inhibitor (LY3039478), siWISP-1, and WISP-1 neutralizing antibody reversed anti-proliferative effects of ApoSQ-CAF CM and ApoA-CAF CM in lung cancer cells. Direct treatment of recombinant WISP-1 protein (rWISP-1) at relatively low concentrations (20-100 ng/ml) into lung cancer cells also reduced cell proliferation activities in a dose-dependent manner. These data confirmed that WISP-1 secretion through the Notch1-WISP-1 signaling pathway in CAFs exposed to apoptotic cancer cells mediates anti-proliferative effects in lung cancer cells. Moreover, direct treatment with rWISP-1 also suppressed the proliferation of lung cancer cells via STAT1. Therefore, treatment with apoptotic lung cancer cells-CAF CM could be therapeutically applied to inhibit cancer cell proliferation.;사멸화 암 세포와 암 미세환경의 상호작용은 암의 성장, 증식, 전이를 조절한다. 본 연구에서 사멸화 암 세포에 노출된 cancer-associated fibroblasts (CAFs)의 배양액 (CAF CM)이 암 세포의 증식을 억제한다는 것을 밝혀냈다. Cell viability assay, qRT-PCR, western blot, colony formation assay 실험법을 사용하였다. 이 실험들에서 사멸화 344SQ, A549 세포에 노출된 CAFs의 배양액이 암세포 증식을 억제한다는 것을 확인하였다. 면역형광세포 염색을 통하여 암 세포에 사멸화 암 세포에 노출된 CAFs 배양액을 처리하는 것이 인산화-STAT1과 p21의 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 암 세포에 STAT1 특이적 siRNA 형질전환 또는 STAT1 억제제를 처리하는 것은 암 세포 증식 억제효과를 역전 시킨다. 그러나 STAT1이 과발현 된 344SQ 암 세포에서는 암 세포 증식 억제효과가 더욱 커지는 것을 확인 하였다. 또한 CAFs 에서 siNotch1, Notch1 억제제 (LY3039478), siWISP-1, WISP-1 중화항체를 통한 Notch1-WNT1-inducible-signaling pathway protein 1 (WISP-1)의 억제가 사멸화 344SQ-CAF 배양액과 사멸화 A549-CAF 배양액이 가지는 암 억제 효과를 역전 시킨다는 것을 확인 하였다. 암 세포에 상대적으로 저농도의 (20-100 ng/ml) recombiant WISP-1 단백질 (rWISP-1)을 직접처리하면 암 세포의 증식이 농도 의존적으로 억제되었다. 이 결과들은 사멸화 암 세포에 노출된 CAFs의 Notch1-WISP-1 signaling pathway에서 분비되는 WISP-1이 암 세포의 항 증식 작용을 조절한다는 것을 의미한다. 그리고 STAT1 siRNA로 형질전환 시킨 344SQ 세포에 rWISP-1을 처리함으로써 rWISP-1의 암 세포 증식 억제 효과가 STAT1을 통한 것임을 확인하였다. 그래서 사멸화 암세포에 노출된 CAFs의 배양액이 암 증식 억제를 위한 치료에 적용될 수 있을 것 이라고 생각된다.