Identification of novel biomarkers associated with cognitive functions

Abstract

Part I SuperAgers are old people who exhibit cognitive functions that are comparable to that of an average middle-aged individuals. We aimed to identify genomic loci with polymorphism specific to SuperAgers. We recruited cognitively healthy 91 individuals aged older than 60. Participants were classified as SuperAgers if they are scored at or above the mean values for people in 40’s in the Seoul Verbal Learning Test (SVLT) and the Rey Osterrieth Complex Figure Test (RCFT). Participants with age-comparable scores were classified as typical agers. We collected bloods from 44 SuperAgers and 47 typical agers and isolated DNA. Genome-wide association study (GWAS) evaluating single nucleotide polymorphism (SNP) variables were done. We conducted marker quality control test with Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE). Ten significant genetic variants (P <10-3) were identified among total 541,571 variants. Genome-wide significant SNP-based associations in 10 genomic regions were discovered (rs35216768, rs626912, rs16835606, rs880943, rs382572, rs2471279, rs6470616, rs8034281, rs11643638, and rs758224). SNPs are located near genes including FHIT, ROBO2, ZNF717, KALRN, TACR3, CXXC4, HTR1A, IPO11, SLC37A3, JHDM1D-AS1, LINC00824, MIR1208, PPCDC, C15orf39, LOC100506172, LOC101928035, HS3ST3A1, LOC100506974, and CDRT15P1. Several genes related to SNPs (FHIT, ROBO2, KALRN, TACR3, HTR1A, PPCDC, and JHDM1D-AS1) are known to affect neuronal functions. FHIT is known to function in microtubule assembly and thus is important in neurogenesis in brain. ROBO2 and KALRN are related to development of nervous system and TACR3 is related to brain function like mood or learning and memory skills. HTR1Ais known to regulate neurotransmitter signaling pathway. PPCDC is enriched in CNS microglia and PNS macrophages. JHDM1D-AS1 has neuroprotection effects in Parkinson’s disease-induced cells. In addition, we found that SNP-related genes whose functions are uncharacterized are also included in the genomic loci for SuperAgers (LINC00824, C15orf39, LOC100506172, LOC101928035, LOC100506974, and CDRT15P1). Part II Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is one of the key factor regulates cholesterol metabolism through regulating LDL receptor (LDLR). There are many study for roles of PCSK9 in lipoprotein metabolism but there has not been a study for roles of PCSK9 in brain function. In this study, we evaluate if PCSK9 affects brain functions. We fed wild type and PCSK9-null (PCSK9-/-) mice a normal chow diet or western diet for 11 weeks. Mouse behavioral tests including open field test (OFT), novel object recognition test (NORT), elevated plus maze test (EPM), and passive avoidance test (PAT) were performed to test locomotor activity, long-term memory, fear-motivated memory, and anxiety. The next day, glucose tolerance test (GTT) was performed. After 3-4 days for recovery, we sacrificed mice and analyzed blood lipids including total cholesterol (TC), triglyceride (TG), high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C), and low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C) in serum. WD-fed mice showed higher levels of TC, HDL-C, and LDL-C than normal chow diet-fed mice. In the western diet-fed mouse group, PCSK9-/- mice showed lower level of TC, HDL-C, and LDL-C than wild type mice, but in normal chow diet-fed mouse group, PCSK9-/- mice showed lower level of TC than wild type mice. We performed OFT to assess locomotor activity and anxiety. PCSK9-/- mouse and PCSK9 mAb-injected mouse group did not showed difference in ‘distance traveled’. There was no difference in ‘time spent outside’ and ‘time spent in center’ in PCSK9-/- mice. However, PCSK9 mAb-injected mice fed with western diet showed lower time spent outside and longer time spent in center than control mice. This suggests that PCSK9 mAb-injected mice fed a western diet showed low anxiety. We performed NORT to assess long-term memory. PCSK9-/- mice showed no difference in ‘total exploration time’, ‘novel object exploration time’, and ‘discrimination index (which indicates long-term memory)’ compared to wild type mice both in normal chow iet and western diet. Normal chow diet-fed mice, injected PCSK9 mAb, showed higher exploration time than control mice We performed EPM to evaluate long-term memory and anxiety. PCSK9-/- mice on a western diet spent longer time in open arms both in trial 1 and trial 2 compared to control mice. They also showed higher number of time to entrance into open arms in trial 2 compared to control mice fed with western diet. It suggests western diet-fed PCSK9-/- mice showed low anxiety. There was no difference in long-term memory between PCSK9-/- and wild type mice. PCSK9 mAb did not affect anxiety both in trial 1 and trial 2 in EPM. Normal chow diet-fed mice, injected PCSK9 mAb, showed higher latency time to enter the closed arms in trial 1, but there was no difference in latency time to enter the closed arms in trial 2 and learning index. It suggests PCSK9 mAb did not affect long-term memory. We performed PAT to assess fear-motivated memory. PCSK9-/- mice fed a normal chow diet showed markedly higher scores in ‘latency time to enter the dark room in trial 2’ and ‘learning index’ than wild type mice. PCSK9 mAb-injected mice fed a normal chow diet also showed higher scores in ‘latency time to enter the dark room in trial 2’ and ‘learning index’. It suggests that PCSK9 might affect fear-motivated memory ability. We also assessed the correlation between lipid markers and PAT scores (entry time latency) all of mice and the results showed that LDL-C level is negatively associated with PAT score in western diet group. We performed hippocampal transcriptome analysis to identify PCSK9-associated genetic alterations in brain. Total 36 genes were differentially expressed in PCSK9-/- mouse hippocampus compared with wild type mice in the normal chow diet-fed group (FDR ≤ 0.05 and ｜FC｜ ≥ 1.5). Eleven out of 36 differentially expressed genes (DEGs) are associated with transcription regulation in developmental process including Wnt/β-catenin signaling pathway. This study aims to find out roles of PCSK9 in cognitive function and reveals that PCSK9 affects contextual fear conditioning and differential expression of genes in hippocampus. We suggests one evidence that PCSK9 affects brain function and more studies for the mechanism by which PCSK9 affects cognitive function and expression of genes in brain should be followed.;PCSK9은 세포막에 발현되는 LDLR를 분해함으로써 콜레스테롤 대사를 조절하는 핵심 인자이다. PCSK9이 지질단백질 대사에 미치는 역할에 대한 연구는 많이 이루어졌지만 인지능과 PCSK9의 연관성을 분석한 연구는 거의 없었다. 본 연구에서는 PCSK9이 인지능에 미치는 영향을 마우스 실험을 통해 증명하였다.야생형 마우스와 PCSK9 돌연변이 마우스에게 11주간 일반식이와 웨스턴 식이를 공급한 뒤, 네 가지 행동실험 (오픈 필트 테스트, 신규 물체 인식 테스트. 십자형 높은 미로 테스트, 수동회피실험)을 진행하였다. 다음 날, 경구포도당부하검사를 진행한 뒤에 3일간 회복 기간을 가진 후 마우스를 안락사시켰다. 웨스턴 식이를 먹인 마우스는 일반 식이를 먹인 마우스에 비해 혈중 총 콜레스테롤, 고밀도지질단백질, 저밀도지질단백질이 증가했다. 웨스턴 식이를 한 PCSK9 돌연변이 마우스는 같은 식이를 한 대조군에 비해 총 콜레스테롤, 고밀도지질단백질, 저밀도지질단백질이 감소했으나, 일반식이에서는 총 콜레스테롤 외에는 PCSK9에 의한 차이를 보이지 않았다. 오픈 필트 테스트 결과, 마우스 간 이동 거리는 차이가 없었다. PCSK9 억제제 투여와 웨스턴 식이를 병행한 마우스는 가운데에 머무르는 시간이 길었고, 이는 다른 그룹에 비해 불안도가 낮음을 의미한다. 신규 물체 인식 테스트 결과, PCSK9 돌연변이 마우스는 대조군과 장기기억의 차이를 보이지 않았다. PCSK9 억제제 투여와 일반 식이를 병행한 마우스는 대조군보다 탐색 시간이 증가했으나, 마찬가지로 장기기억에는 차이를 보이지 않았다. 십자형 높은 미로 테스트 결과, 웨스턴 식이를 먹은 PCSK9 돌연변이 마우스는 대조군에 비해 열린 팔에 머무르는 시간이 길었고, 이는 불안도가 낮음을 의미한다. PCSK9 돌연변이 마우스와 대조군 간의 장기기억에는 차이가 없었다. PCSK9 억제제를 투여한 마우스는 대조군과 불안도에 있어 차이를 보이지 않았다. PCSK9 억제제와 대조군 간에도 마찬가지로 장기기억에는 차이가 없었다. 수동회피실험 결과, 일반식이를 먹은 PCSK9 돌연변이 마우스가 대조군에 비해 정서 기억이 크게 증가했다. PCSK9 억제제 투여와 일반식이를 병행한 마우스도 마찬가지로 대조군에 비해 정서 기억이 증가하였다. 그러나 웨스턴 식이를 먹이면 정서 기억이 약간 감소하며, PCSK9과 대조군 간의 차이는 사라진다. 이는 PCSK9 단백질이 정서 기억 형성에 관여하며, 웨스턴 식이는 PCSK9에 의한 정서 기억 형성을 방해하는 것으로 보인다. PCSK9을 억제하면 혈중 콜레스테롤 농도가 변하기 때문에, 수동회피실험 반응 결과와 네 종류의 콜레스테롤 간의 상관관계 분석을 진행하였다. 그 결과, 저밀도지질단백질이 수동회피실험반응과 역상관관계를 보임을 확인하였다. 웨스턴 식이는 혈중 콜레스테롤 농도를 높이기 때문에, 저밀도지질단백질 결과를 일반식이와 웨스턴 식이로 나누어 수동회피실험반응 결과와 상관관계 분석을 진행하였다. 그 결과, 일반 식이에서는 저밀도지질단백질과 수동회피실험반응 간의 유의한 상관관계가 없었으나, 웨스턴 식이를 할 경우 저밀도지질단백질과 수동회피실험반응이 역상관관계를 보임을 확인하였다. 정서 기억은 뇌, 특히 편도체와 해마와 기능적으로 연관되어 있기 때문에 마우스 뇌에서 해마를 분리하여 전사체 분석을 수행했다. 일반식이를 한 PCSK9 돌연변이 마우스를 야생형 마우스와 비교했을 때 총 36개의 차등발현유전자가 검출되었다. 이 중 11개는 Wnt/β-catenin을 포함한 발달 과정에 밀접하게 관련되어있으며, 유전자 발현을 조절하는 단백질임을 확인했다. 본 연구는 PCSK9이 지질 대사 외에 새로운 기능에 미치는 역할을 규명하기 위해 인지능과의 연관성을 탐색하였다. 수동회피실험반응 결과를 통해 PCSK9은 공포반응에 의한 정서 기억 형성과 관련되어있음을 확인했으며, 전사체 분석을 통해 해마의 발달 기전과 관련된 유전자들이 차등발현됨을 확인하였다. 우리는 PCSK9이 인지능에 미치는 영향 및 차등 발현되는 유전자들을 확인하였으며, 이와 관련한 추가 연구를 진행하고자 한다.