Development of non-equilibrium based DNA hybridization for ultra-fast quantification of functional genes

Abstract

Responding to environmental accidents requires rapid and accurate identification of contamination. However, conventional genomic detection methods such as qPCR are highly sensitive and specific, but they are also time-consuming. Thus, an ultra-fast non-equilibrium-based assay could detect microbial functional genes in 2 minutes, addressing the time-consuming limitations of existing methods. The 2-minute time point represents a non-equilibrium state for DNA hybridization. This assay measured fluorescence using SYBR Green I, which intercalates into the target DNA-probe DNA hybridization sites. The rate of fluorescence change over 2 minutes is directly proportional to the target DNA concentration, ranging from 1 µM to 15 µM (R2 = 0.96). This allows for quantitative analysis of specific target DNA and the analysis of DNA hybridization kinetics. The selectivity (%) of the assay for specific target DNA sequences was investigated using mismatched probe DNA (1, 2, 3, and 10 bp). This developed assay, concentrations of target DNA, probe DNA and SYBR Green I are important for ensuring efficient quantitative detection. Improving the time-consuming problem is the most remarkable achievement of ultra-fast non-equilibrium-based DNA hybridization.;본 연구의 최종 목표는 수 분 내 미생물 유전자를 검출할 수 있는 기술의 개발이다. 미생물 검출 기술은 수질 조사 및 수질 오염사고 발생 시 환경 역학 조사와 현장 제어 및 추적에 있어 신속한 대응이 가장 중요한 요소임에도 불구하고 기술 자체의 복잡성과 검출 속도에서 한계를 가진 전통적인 현미경계수법, 막여과법 등이 미생물 검출에. 이용되고 있다. 미생물 정량을 위한 DNA 기반의 분자생물학적 기술 중 가장 많이 사용하는 qPCR은 복잡한 최적화 및 형광 염료 선정을 통해 여러 종류의 미생물을 동시에 다중 분석하고자 할 경우 qPCR의 최대 장점인 정량적 측정 능력이 감소한다. 또한, NanoGene assay 기술의 경우 마그네틱비드와 형광나노입자에 결합한 probe DNA, 형광나노입자에 결합한 signaling DNA와 검출 대상 유전자의 혼성화와 형광측정을 통해 검출 대상 유전자를 고선택성으로 정량할 수 있지만 DNA 혼성화 과정에서 하루 이상의 시간이 소요된다는 한계를 가지고 있다. 따라서 본 연구에서는 유류 분해능을 가지고 있는 미생물 균주인 Pseudomonas putida의 유전자를 2분 내에 빠르게 검출할 수 있는 바이오 센싱 기술을 개발하였다. DNA 혼성화와 SYBR Green I의 intercalation 반응에 대하여 비평형 기반, 속도를 측정하여 유전자를 정량하였다 (R2=0.96). 이는 수질오염사고 발생 시 현장에서 신속하게 미생물을 검출할 수 있는 기술로서 활용 될 수 있을 것으로 기대된다.