The role of the hyaluronan network reconstructed by ZEB1 in lung tumor microenvironment

Abstract

Hyaluronan (HA), a fundamental component of the extracellular matrix (ECM), plays a pivotal role as a protective barrier for neighboring cells, shielding them from a spectrum of environmental stresses. In various epithelial cancers, HA is involved in facilitating the epithelial–mesenchymal transition (EMT) and metastasis. However, the intricate mechanisms by which cancer cells manipulate the HA network to modulate cancer progression and metastasis within the tumor microenvironment (TME) remain unknown. This study reveals that Inter-α-trypsin inhibitor-2 (ITIH2), a HA-binding protein, plays a critical role in the development of the HA network. Interestingly, ITIH2 is found to be secreted from mesenchymal-like lung cancer cells when co-cultured with cancer-associated fibroblasts. The expression levels of ITIH2 show a positive correlation with those of ZEB1, a potent EMT-inducing transcription factor, in lung cancer cells and The Cancer Genome Atlas (TCGA)-lung adenocarcinoma data. Additionally, ZEB1 was proved to be a transcription activator for ITIH2 through promoter assay and chromatin immunoprecipitation assay. Knockdown of ITIH2 in lung cancer cells reduced cell migration and invasion and also effectively inhibited metastasis. Inhibition of ITIH2 expression reduced HA matrix formation around cancer cells and HA cable formation between cells. These findings were similarly observed in lung cancer cells when ZEB1 was suppressed. This study further confirmed that ZEB1 indeed functions as a transcriptional regulator of HAS2, a hyaluronan synthase. ZEB1 and HAS2 have a positive correlation in their mRNA expression levels in TCGA data, which supports this collaborative effort. Depleting or inhibiting HAS2 significantly reduced the formation of the HA network, subsequently impacting the migration and invasion capabilities of lung cancer cells. Also, ZEB1 regulates the alternative splicing and isoform expression of CD44, a prominent HA receptor. When CD44 was silenced through siRNA-mediated knockdown, the motility and invasiveness of lung cancer cells were significantly suppressed. In addition, to identify ITIH2-specific inhibitors, a deep learning-based algorithm for drug-target interaction was adopted in this study. Sincalide, a candidate inhibitor against ITIH2, emerged as a remarkable entity through this approach, demonstrating its ability to obstruct the formation of the HA network and inhibited the migration of lung cancer cells. Furthermore, sincalide treatment inhibits the growth of metastatic tumors in a mouse model of lung cancer. Collectively, these results highlight ZEB1 as the key regulator behind the pro-metastatic HA network within the TME. ZEB1 reconstructs the HA network to ultimately create a pro-metastatic ECM environment by intricately regulating ITIH2, HAS2, and CD44. This presents a novel strategy for targeting the HA network, potentially inhibiting the progression and metastasis of lung cancer.;세포외 기질의 기본 구성 요소인 히알루로난은 주변 세포를 보호하는 장벽 역할을 하여 다양한 환경 스트레스로부터 세포를 보호한다. 다양한 상피암에서 히알루로난은 상피-중간엽 전이 및 암 전이를 촉진하는데 관여한다. 그러나 암세포가 히알루로난 네트워크를 조작하여 종양 미세환경 내에서 암 진행 및 전이를 조절하는 복잡한 메커니즘에 대해서는 자세히 알려져 있지 않다. 이 연구는 히알루로난 결합 단백질인 ITIH2가 히알루로난 네트워크의 발달에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 흥미롭게도 ITIH2는 암 연관 섬유아세포와 함께 배양할 때 중간엽 유사 폐암 세포에서 분비되는 것으로 밝혀졌다. ITIH2는 폐암 세포와 폐 선암종 TCGA 데이터에서 상피-중간엽 전이 유도 전사 인자인 ZEB1과 양의 상관관계를 보여준다. 또한, ZEB1은 프로모터 분석 및 염색질 면역침전 분석을 통해 ITIH2의 전사를 활성화한다는 것을 보여주었다. 암 세포에서 ITIH2의 발현억제는 세포 이동과 침윤을 감소시켰고 전이를 효과적으로 억제했다. 또한, ITIH2 발현억제는 암세포 주변의 히알루로난 매트릭스 형성과 세포 사이의 히알루로난 케이블 형성을 감소시켰다. 이러한 결과는 폐암 세포의 ZEB1 발현억제에서도 유사하게 관찰되었다. 이어서 ZEB1이 히알루로난 합성효소인 HAS2의 전사 조절인자로 기능한다는 것을 추가로 입증했다. TCGA 데이터는 ZEB1과 HAS2가 양의 상관 관계를 갖는다는 것을 보여주었다. 또한, 폐암 세포에서 HAS2를 감소시키거나 억제하면 히알루로난 네트워크의 형성이 크게 감소하여 결과적으로 암세포의 이동 및 침윤 능력을 저하시킨다는 것을 확인하였다. ZEB1은 대표적인 히알루로난 수용체인 CD44의 선택적 스플라이싱과 isotype 발현을 조절한다고도 알려져 있다. 이 연구에서도 CD44가 발현억제되면 폐암 세포의 운동성과 침윤성이 크게 억제된다는 것을 확인하였다. 더 나아가 ITIH2 특이적 억제제를 선별하기 위해 본 연구에서는 약물-표적 상호작용에 대한 딥러닝 기반 알고리즘을 활용하였다. 이 방법으로 선별된 후보 ITIH2 억제제인 sincalide는 히알루로난 네트워크의 형성을 방해하고 폐암 세포의 이동을 억제하는 능력을 보여주었다. 또한, 폐암 마우스 모델에서 sincalide 처리가 종양의 전이를 억제한다는 것을 확인하였다. 결과적으로, 이러한 연구결과는 종양 미세환경에서 ZEB1이 ITIH2, HAS2 및 CD44를 정교하게 조절하여 히알루로난 네트워크를 재구성하는 핵심 조절자이자 전이성 세포외기질을 조성하는 인자임을 입증한다. 이를 기반으로, 본 연구는 히알루로난 네트워크를 표적으로 삼아 궁극적으로 폐암의 진행과 전이를 억제할 수 있는 새로운 전략을 제시한다.