Regulation of immune checkpoint molecules by bidirectional interactions between human natural killer cells and cancer cell lines

Abstract

Natural killer (NK) cells play a crucial role in the innate immune response against malignant tumors. Both NK cells and cytotoxic T lymphocytes (CTLs) function as effector cells in the immune system and share similar cytotoxic pathways in anti-tumor activity. It is recently reported that immune checkpoint (IC) receptors are expressed on not only T cells but also NK cells. IC receptor-ligand interactions can hinder the activation of both T cells and NK cells and suppress their ability to eradicate cancerous cells. Nevertheless, the number of studies investigating the role of IC molecules in the interaction between NK cells and cancer cells is limited in comparison to T cells. If NK cells express inhibitory IC receptors and cancer cells have cognate IC ligands, the cancer cells would inhibit the NK cells. Therefore, I investigate the potential alterations in the expression of IC ligands upon the interaction between human primary NK cells and cancer cell lines, as well as the subsequent modifications in NK cell functionality. All experiments were conducted using NK cells that were isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy donors. Initially, I assessed the level of expression of IC ligands on cancer cell lines derived from various organs. The confirmed IC ligands are PD-L1 (PD-1 ligand), Galectin-9 (Tim-3 ligand), and LSECtin (Lag-3 ligand). I observed an increase in the expression of PD-L1, Galectin-9, LSECtin, on A549 cells (lung cancer cell line), Huh7 cells (liver cancer cell line), and T47D cells (breast cancer cell line) after co-cultured with NK cells. In subsequent experiments, to investigate which elements of NK cells are responsible for upregulating IC ligands on cancer cell lines, I used recombinant cytokines (IFN-γ, TNF-α) and the transwell system. Furthermore, it was investigated whether the IC ligands did not increase when cytokines were blocked. The results showed that IC ligands on A549 were primarily upregulated by soluble factors, including cytokines released from NK cells. In contrast, the increase of IC ligands on Huh7 and T47D showed mostly relied on direct cell-to-cell contact rather than soluble factors. I anticipated that NK cells might also undergo phenotypic and functional changes when co-cultured with cancer cell lines. The alteration of IC receptors, such as Tim-3, Lag-3 and PD-1, as well as the activation markers CD25 and CD69, were verified in the NK cells. To evaluate NK cell function, the degranulation and IFN-γ secretion, which are crucial functional components of NK cells, were analyzed. The NK cells that encountered the cancer cell lines exhibited lower CD107a expression (degranulation) than NK cells that did not encounter cancer cell lines. This result indicated the impaired functionality of NK cells caused by cancer cell lines. These attenuated functions of NK cells were effectively restored, in part, by IC receptor (Tim-3, Lag-3, PD-1) blockade. In summary, the bidirectional interplay between NK cells and cancer cell lines hampered the function of NK cells by modulating the expression of IC molecules. A549 cells were influenced by the soluble factors of NK cells to regulate IC ligands, while Huh7 cells and T47D cells relied on direct cell-to-cell contact to increase IC ligands. In IC molecule modulation, a better understanding of the mechanism of interactions between NK cells and cancer cells may contribute to the significant improvements in tailored treatment according to various cancer types. I suggest that employing NK cells and immune checkpoint inhibitors as a treatment modality, in addition to T cells, could enhance the effectiveness of cancer immunotherapy.;자연살해세포(NK 세포)는 바이러스 감염 세포와 악성 종양 세포에 대응할 수 있는 선천면역 림프구이다. 자연살해세포와 세포독성 T 림프구는 모두 면역계에서 효과기 세포로 기능하며, 항종양 활동에서 유사한 세포독성 경로를 공유한다. 최근 면역관문분자가 T 세포뿐만 아니라 자연살해세포에서도 발현된다는 보고가 있다. 면역관문 수용체와 리간드의 상호작용은 면역세포의 활성화를 방해하여 항종양활성을 억제시킨다. 하지만 자연살해세포와 암세포의 상호작용에서 면역관문분자의 역할을 규명하는 연구는 T 세포에 비해 제한적이다. 따라서, 본 연구에서는 인간 일차 자연살해세포와 암세포 간의 상호작용에 따른 면역관문 발현의 잠재적 변화와 그에 따른 자연살해세포 기능 변화에 대한 연구를 진행하였다. 폐암 세포주인 A549, 간암 세포주인 Huh7, 유방암 세포주인 T47D는 자연살해세포와 공동배양 후, 공동배양 하지 않은 대조군과 비교했을 때보다 면역관문 리간드 PD-L1, Galectin-9, LSECtin을 더 많이 발현하고 있었다. 자연살해세포의 어떠한 요소가 암세포에서 면역관문 리간드를 상승시켰는지 알아보기 위해 재조합 인간 IFN-γ, TNF-α 혹은 transwell을 사용하여 암세포와 자연살해세포를 공동배양 하였다. 그 결과, A549의 면역관문 리간드는 자연살해세포에서 방출된 사이토카인을 포함한 가용성 인자에 의해 상향조절되는 반면, Huh7 및 T47D의 면역관문 리간드는 가용성 인자보다 직접적인 세포 간 접촉에 더 큰 의존성을 나타냄을 보여주었다. 자연살해세포 또한 암세포와 공동배양 후, 표현형 및 기능적 변화를 수반할 수 있을 것으로 예상하고 이를 확인해보았다. 암세포와 공동배양 후, 자연살해세포 집단에서 면역관문 리간드인 Tim-3, Lag-3, PD-1 및 자연살해세포의 활성화 마커인 CD25, CD69의 변화가 확인되었다. 더 중요하게는, 자연살해세포의 기능적 지표를 나타내는 탈과립 정도인 CD107a의 발현이 암세포와 공동배양 후 낮아진 것을 확인하였고 이는 암세포에 의해 자연살해세포의 기능이 약화되었다는 것을 나타낸다. 이러한 자연살해세포의 약화된 기능은 면역관문 수용체-리간드 차단을 통해 부분적으로 회복되었다. 요약하면, 자연살해세포와 암세포의 양방향 상호작용은 면역관문 분자의 발현을 조절하고 자연살해세포를 약화시켰다. 면역관문 분자 조절에서 자연살해세포와 암세포 사이의 메커니즘을 더 잘 이해한다면 다양한 암 유형에 따른 맞춤형 치료에서 상당한 발전을 기대할 수 있을 것이다. 또한 T 세포뿐만 아니라 자연살해세포를 치료 방식으로 사용할 때 면역관문 억제제와 병용한다면 암 면역 치료의 효과가 향상될 수 있을 것으로 기대된다.