Structural and functional investigation into a novel transcriptional regulator EnfR controlling the hydrogen production in a hyperthermophilic archaeon Thermococcus onnurineus NA1

Abstract

Thermoccus onnurineus NA1은 호열성 카르복시 영양 고균이며 일산화탄소 탈수소효소 (CODH) 유전자 클러스터를 암호화하는 단백질에 의해 촉매되는 CO의 산화를 통해 수소를 생성한다. TON_1525는 N-말단에 DNA 결합 Helix-Turn-Helix (HTH) 모티프가 있는 codh 유전자 클러스터의 발현을 조절하는 잠정적 전사 억제제이다. 이전의 보고에 따르면, TON_1525단백질에 T55I 돌연변이가 도입될 경우, codh 유전자 클러스터의 발현이 증가하며 T. onnurineus의 수소생산성이 상당히 증대되는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 TON_1525의 구조적, 분자적 characterization을 수행하였다. TON_1525는 이량체로 구성되어있는 단백질이며, 단량체의 경우에는 ‘8분 음표 (♪)' 기호와 같은, 이전에는 밝혀지지 않은 새로운 folding (이하, eighth-note fold regulator, EnfR이라고 함)을 갖고 있었다. EnfR의 이량화 모드는 Protein Data Bank (PDB)에 구조적 호몰로그가 없다는 점에서 특별하다. DNaseI footprinting 및 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)에 따르면, EnfR은 codh 유전자 클러스터의 프로모터 영역 중 36-bp 유사-팔린드롬 서열을 갖는 부위에 결합할 수 있으며, 이는 in silico EnfR/DNA 복합체 모델을 통해서도 확인되었다. In silico 복합체 모델에서 DNA와의 결합에 참여하는 잔기의 돌연변이 연구를 통해 EnfR의 N-말단 loop과 HTH 모티프가 타겟 DNA 서열을 인식하는 데 중요하다는 것 또한 증명하였다. T. onnurineus의 수소 생산 증가와 연관이 있는것으로 보이는 EnfR T55I 돌연변이의 DNA 결합 친화도는 야생형 대비 약 15배 이상 낮아졌으며, 이는 T55I 돌연변이에서 N-말단 루프의 구조 변화가 DNA 결합과 인과성이 있음을 시사한다.부록에서는 박테리아 유래β-lactamase 효소와 리간드의 복합체 구조에 관해 다루고 있다. β-lactam계열 항생제는 전 세계 세균 감염 치료에 가장 많이 사용되는 약물이다. 그러나 박테리아는 β-lactamase라는 효소를 생성하여 β-lactam 항생제를 가수분해 할 수 있고, 그 결과 항생제는 무력화된다. 따라서 β-lactamase는 항생제 내성의 주요 인자로 간주된다. ACC-1은 병원성 폐렴을 유발하는 Klebsiella pneumoniae에서 확인된 class C β-lactamase이다. 본 연구에서는, ACC-1의 7개의 결정 구조가 제시되었다. Apo ACC-1과 cefotaxime, cefoxitin, imipenem, 그리고 meropenem이 결합한 acylated ACC-1 구조의 비교를 통해 각 리간드의 결합 모드를 설명하고, 이를 바탕으로 서로 다른 촉매 효율을 설명하고자 하였다. 본 구조기반 활성분석 연구는 noncanonical β-lactamase인 ACC-1뿐 아니라 다양한 class C β-lactamase의 분자 기반 지식을 확장하는 데 도움이 될 것이다.;Thermococcus onnurineus NA1 is a hyperthermophilic carboxydotrophic archaeon and produces H2 through the oxidation of CO catalyzed by proteins encoding a carbon monoxide dehydrogenase (CODH) gene cluster. TON_1525, with an N-terminal DNA-binding helix-turn-helix (HTH) motif, is a putative transcriptional repressor controlling the expression of the codh gene cluster. According to previous research, the T55I mutant of TON_1525 led T. onnurineus to produce enhanced H2 production resulting from the increased expression of genes in the codh cluster. In this research, structural and molecular characterization of TON_1525 was executed. TON_1525 was demonstrated to be a dimeric protein. Monomeric TON_1525 has a novel ‘eighth-note (♪)’ symbol-like fold (hereafter referred to as eighth-note fold regulator, EnfR), and the dimerization mode of EnfR is unique in that there are no structural homologs in the Protein Data Bank. According to DNaseI footprinting and electrophoretic mobility shift assays (EMSA), dimeric EnfR binds onto a 36-bp pseudo-palindromic region in the promoter of the codh gene cluster, which is underpinned by an in silico EnfR/DNA complex model. Mutational studies for EnfR proved the N-terminal loops and HTH motifs to be important in recognition of the target DNA sequences. The DNA-binding affinity of the T55I mutant, which led to increased H2 production of T. onnurineus was lowered over ~15-fold, suggesting the conformational change of N-terminal loops in the T55I mutant is responsible for the DNA binding.Antimicrobial resistance (AMR) is an urgent problem threatening global public health. One of the main reasons causing AMR is β-lactamase, an enzyme bacteria produces. ACC-1 is a plasmid-encoded class C β-lactamase identified in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella enterica, etc. ACC-1-producing bacteria are resistant to oxyimino cephalosporins, whereas they are susceptible to cefoxitin. This study describes the crystal structures of apo ACC-1, adenylylated ACC-1, and acylated ACC-1 complexed with cefoxitin and cefotaxime. The adenylate covalently bonded to the nucleophilic Ser64 shows tetrahedral phosphorus mimicking the deacylation transition state. Cefotaxime in ACC-1 has a proper conformation for substrate-assisted catalysis in that its C4 carboxylate and N5 nitrogen are adequately located to facilitate the deacylation reaction. On the other hand, cefoxitin in ACC-1 has a different conformation in that those functional groups can-not contribute to catalysis. In addition, the orientation of the deacylating water relative to the acyl carbonyl group in ACC-1 seems unsuitable for nucleophilic attack. In addition, the crystal structures of the ACC-1 Y150F variant in apo and acylated forms complexed with two carbapenems, meropenem and imipenem, regarded as an ‘anti-biotics of last resort’ for the treatment of antibiotic-resistant superbug are also presented. They are known to bind to the ACC-1 in an unreported manner. Through salt bridges with Lys67 and Lys315, the C3 carboxylate in their pyrroline ring is fixed where the deacylation water occupies in other acylated enzymes. The accompanying structural alterations of ACC-1 are remarkable. The side chain of the catalytic base at position 150 is rotated toward the R2 loop that is rigid in the apo-state but becomes disordered on carbapenem binding. This indicates why carbapenems are regarded as poor substrates of ACC-1.