Therapeutic effect of a p62 ZZ ligand in acetaminophen-induced hepatotoxicity

Abstract

Purpose: Hepatotoxicity induced by acetaminophen (APAP) overdose is the leading cause of drug-induced liver damage worldwide. Autophagy is a degradation process in which various cargoes are collected by autophagic receptors such as p62/SQSTSM- 1/Sequestosome-1 and targeted autophagosomes for lysosomal degradation. Here, I investigated the protective role of p62-mediated selective autophagy in APAP-induced liver injury and explored p62 as a drug target to clear cytotoxic substances such as misfolded protein aggregates and damaged mitochondria in this pathogenic process. Experimental Approach: Hepatotoxicity was induced by intraperitoneal injection of APAP (500 mg/kg) in 6-week-old C57BL/6 male mice. YTK-2205 (20 mg/kg), a small molecule ligand for the ZZ domain of p62, was administered either concurrently with APAP or post-administration. Western blotting and immunocytochemistry were performed to investigate the mechanism. Results: Liver suffering from APAP-induced hepatotoxicity induced N-terminal arginylation of the molecular chaperone calreticulin reto-translocated in the endoplasmic reticulum (ER), and YTK-2205 exhibited notable therapeutic efficacy in acute hepatotoxicity as assessed by the levels of serum alanine aminotransferase (ALT) and hepatic necrosis. This efficacy was significantly attributed to accelerated degradation of ubiquitin (Ub) conjugates as well as damaged mitochondria and ER. YTK-2205 induced colocalization of p62+/LC3+ phagophore to the sites of mitophagy and ER-phagy in primary murine hepatocytes and Hep3B cells treated with APAP and N-acetyl-p- benzoquinone imine (a putative toxic APAP metabolite), respectively. Conclusion: The results indicate that activation of p62-mediated autophagy contributes to protection from APAP hepatotoxicity by promoting clearance of ubiquitinated substrates formed by APAP overdose. Small molecule ligands for p62 could be developed as drugs to treat this pathological condition.;아세트아미노펜 과다복용으로 유발된 간독성은 전 세계적으로 약물 유발 간손상의 주요 원인입니다. 자가포식은 p62/SQSTSM-1/Sequestosome-1과 같은 자가포식 수용체에 의해 다양한 화물을 수집하며 리소좀 분해를 위해 자가포식체를 표적으로 하는 분해 과정입니다. 본 연구는 아세트아미노펜 유발 간 손상에서 자가포식의 보호 역할을 조사하고 잘못 접힌 단백질 응집체 및 손상된 미토콘드리아와 같은 세포독성 물질을 제거하기 위한 약물 표적으로서 p62를 탐구했습니다. 실험 재료 및 방법 6주령 C57BL/6 수컷 마우스에 아세트아미노펜(500 mg/kg)을 복강 주사하여 간독성을 유도했습니다. p62의 ZZ 도메인에 대한 소분자 리간드인 YTK-2205(20 mg/kg)는 아세트아미노펜과 동시 또는 이전에 투여되었습니다. 메커니즘 조사를 위해 웨스턴 블롯팅 및 면역세포화학을 수행하였습니다. 결과 아세트아미노펜-유도 간 독성을 겪고 있는 간에서 소포체(endoplasmic reticulum)에서 역 전위된 분자 샤페론 칼레티쿨린의 N-말단 아르기닐화가 유도되었으며, YTK-2205는 혈청 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase, ALT) 수치와 조직학적 간 괴사로 평가된 아세트아미노펜(500 mg/kg)에 의해 유발된 급성 간독성에서 주목 할 만한 치료 효능을 나타냈습니다. 이 효능은 유비퀴틴62(ubiquitin) 접합체의 가속화된 분해뿐만 아니라 손상된 미토콘드리아 및 소포체의 분해에 크게 기인합니다. YTK-2205는 아세트아미노펜 및 N-아세틸-p-벤조퀴논 이민 (N-acetyl-p-benzoquinone imine, 추정 독성 아세트아미노펜 대사 산물)을 처리한 일차 쥐 간세포 및 Hep3B 세포 모두에서 p62+LC3+ phagophore의 미토파지 및 ER-파지 부위에 공동 국소화를 유도했습니다. 결론 결과는 p62 매개 자가포식의 활성화가 아세트아미노펜 과다복용에 의해 형성 된 유비퀴틴화된 기질 제거를 촉진하여 아세트아미노펜 간 독성으로부터 보호하는데 기여함을 나타냅니다. p62에 대한 소분자 리간드는 이 병리학적 상태를 치료하기 위한 약물로 개발될 수 있음을 시사합니다.