Biosynthetic Pathway for Gentamicin B and Discovery of Novel Gentamicin Intermediates

Abstract

Gentamicin complexes produced by Micromonospora echinospora are one of the most widely used aminoglycoside antibiotics as the important anti-infective agents. Gentamicin is 4,6-disubstituted aminocyclitol composed of 2-deoxystreptamine (2DOS), the centre aminocyclitol moiety, and has several forms such as gentamicin A, X2, B, and C complexes. However, yet its overall biosynthetic pathway remains unclear, because of difficulty in genetic manipulation of producing original strains this class of antibiotics. Among gentamicin complexes, gentamicin B (GB) is a useful starting material for the production of isepamicin, the semi-synthetic aminoglycoside antibiotic, which is weakly toxic but highly antibiotic active. However, GB is only produced in trace amounts by the wild-type M. echinospora which is the producer of the gentamicin C complex. In addition, pharmaceutical gentamicin is known to be a commonly used antibiotic in humans that can induce premature termination codon (PTC) read-through and inhibit nonsense mutations. Therefore, exploring the biosynthetic pathway of GB, the starting material of isepamicin, is an important concern. The main focus of the present study was to characterize the biosynthetic process of GB from 2DOS, which had been unclear for decades through the in vitro enzymatic reactions by expressing the genes involved in two glycosylation, N-methylamination and C-methylation steps among gentamicin biosynthesis genes. Furthermore, we was identify the unknown intermediates in wild-type M. echinospora during GB biosynthesis through in vitro enzymatic reactions. Chapter I gives a brief overview of aminoglycoside antibiotics including gentamicin. The Materials and Methods section of Chapter II provides technical information to elucidate functional characterization of GB biosynthetic genes and structure analysis of new GB intermediates. In chapter III, we biosynthesized GB through in vitro reconstitution, first, the function of first glycosyltransferase GenM1 was elucidated to transfer UDP-N-acetylglucosamine as well as UDP-glucose to 2DOS. The second glycosyltransferase GenM2 was found to attach four pseudodisaccharides as glycosyl acceptors for generation of pseudotrisaccharides. This study suggests that GB can be biosynthesized from 2ʹ-deamino-2ʹ-hydroxyneamine (2ʹDNM) and that the abnormally narrow substrate specificity of a key two glycosyltransferases limit the production yield of GB in the wild-type producer. In addition, we found three new gentamicin A2 intermediates in the biosynthesis of GB. Second, GenD2-GenS2-GenN acted as C3″-methylamination and following C4"-methylation catalyzed by GenD1. These four enzymes sequentially biosynthesized gentamicin X2 analogs from four gentamicin A2 analogs via gentamicin A analogs. This study suggests that GB can be biosynthesized from new gentamicin X2 analog via 2DOS. In addition, in this biosynthetic process we found three new gentamicin A analogs and one new gentamicin X2 analogs. Finally, some of the newly characterized intermediates in the biosynthesis of GB displayed similar PTC read-through activity when compared to G418, one of the strongest read-through inducer of natural aminoglycosides. Compared with the new gentamicin intermediates and the G418, which has PTC read-through activity, it has been shown that the toxicity is reduced and the read-through activity is maintained, which showed the potential for therapeutic applications for genetic diseases. We report here insights into the two glycosylation, C3″-methylamination and C4″-methylation steps that lead form 2DOS to GB as well as seven novel gentamicin intermediates. These results not only revealed an unknown biosynthetic pathway for GB, but also showed the possibility of obtaining clinically useful new aminoglycoside antibiotics in the nature for drug discovery.;젠타마이신 (gentamicin)은 반세기 전부터 사용된 최초의 결핵치료제인 스트렙토마이신(streptomycin)과 같은 계열인 아미노글리코사이드 (aminoglycoside) 계열 항생제로서, 포도상구균과 녹농균 등에 효과가 있는 것으로 알려진 가장 오래된 항생제 중 하나이다. 또한, 의약품으로 사용 되고 있는 젠타마이신은 조기 종결 코돈 (premature termination codon)의 계속적인 정보 번역 (read-through)을 유도하고 넌센스 돌연변이 (nonsense mutation)을 억제할 수 있는 항생제로 알려져 있다. 그러나 항생제의 오남용으로 여러 항생제에 내성을 보이는 다제내성 병원균(multidrug resistant bacteria)이 빈번히 발견되어 기존 항생제의 구조를 변형한 새로운 항생제의 개발이 지속적으로 요구되고 있다. 대표적인 2세대 항생제인 이세파마이신 (isepamicin)은 젠타마이신 B를 원료로 화학 합성을 통해 얻어지는 반합성 항생제로, 아미노글리코사이드의 내성 기작에 작용하는 변형 효소들에 대하여 가장 안정적인 것으로 알려져 있다. 그러나 젠타마이신 B는 젠타마이신 야생생산균주인 마이크로모노스포라 에키노스포라 (Micromonospora echinospora)에서 아주 극소량이 생산된다. 최근 젠타마이신 생합성 과정 중 일부가 알려졌지만, 야생생산균주에서 극소량 생산되는 젠타마이신 B의 생합성 경로 규명은 1972년에 처음 발견된 이후 전 세계 과학자들에게 풀리지 않는 숙제였다. 따라서 자연에서 미생물이 젠타마이신 B을 생합성하는 과정을 규명하고, 이를 기초로 젠타마이신 B를 주생성물이 되도록 조절하는 연구는 필수적이다. 이에 본 논문에서는 그동안 규명되지 못했던 젠타마이신 B의 생합성 중 당전이화 및 C3″ 와 C4″의 메틸아미노화와 메틸화 과정을 완전히 규명하고, 이를 통하여 미생물 내에서 젠타마이신 B가 극소량 생산되는 원인을 파악하고자 하였다. 또한 젠타마이신 B의 생합성 과정에서 유용 활성을 갖는 새로운 중간체들을 발굴하고, 이들을 향후 신약 후보물질 개발을 위한 연구에 활용하는 것을 목적으로 하였다. 본 논문의 3장에서는 첫째, 젠타마이신 B의 생합성 과정 중 당전이단계를시험관내 효소반응 (in vitro reconstitution)을 통해 규명하였다. 젠타마이신 B의 생합성은 두번의 당전이단계를 포함하며, 첫번째 당전이효소(glycosyltransferase)인 GenM1과 두번째 당전이효소인 GenM2가 관여를한다. GenM1에 의한 당전이 효소반응 결과, GenM1은 UDP-Nacetylglucosamine 뿐만 아니라 UDP-Glucose를 공여체 (donor)로 사용됨을 알 수 있었다. GenM2에 의한 두번째 당전이 효소반응 결과, 4개의 슈도이당류들 (pseudodisaccharides)을 글라이코실 수용체 (glycosyl acceptor)로써 사용됨을 확인하였고 각 수용체마다 당전이효소가 받아들이는 활성이 다른 것을 확인하였다. 이는 GenM1 및 GenM2는 기질 특이성을 가지고 있음을 나타낸다. 따라서, 당전이 효소의 낮은 기질 유연성은 젠타마이신 B가 자연에서 미생물로부터 극소량 생산되는데 영향을 미칠 수 있음을 보여준다. 둘째, GenD2-GenS2-GenN 및 GenD1에 의해 촉매화 되는 C3″ 메틸아미노화 및 C4″메틸화 효소반응 수행하였다. 탈수소효소(dehydrogenase)인 GenD2, 아미노 전이 효소 (aminotransferase) GenS2와 메틸 전이 효소 (methyltransferase)인 GenN은 젠타마이신 B의 생합성 과정 중 C3″ 메틸아미노화에 관여 함을 확인하였다. 연속적으로 메틸 전이 효소인 GenD1에 의해 젠타마이신 B의 생합성 과정 중 C4″메틸 화가 일어남을 확인 하였으며, 그리고 이 과정에서 젠타마이신 야생생산균 주에서 알려지지 않은 중간체 7 종을 확인하였다. 마지막으로, 새로운 중간 체 7종들 중 몇몇 중간체들은 넌센스 돌연변이에 의해 생성된 조기 종결 코돈의 계속적인 정보 번역을 유도하는 활성을 보였다. 이와 같은 활성을 가지는 물질들은 조기 종결 코돈을 계속적으로 번역 하도록 하여 정산 단백질의 합성이 가능하도록 한다. G418은 이러한 활성을 가지는 대표적인 물질인 아미노글라이코사이드로 알려져 있다. 젠타마이신 신규 중간체들을 G418과 활성을 비교 하였을 때 독성은 감소되고 계속적인 정보 번역 활성을 유지되 는 특징을 확인하였다. 따라서 이는 유전병 치료에 응용 가능한 잠재력을 보여주었다. 이상의 연구결과는 이세파마이신의 출발물질인 젠타마이신 B의 생합성 경로 중 두 당전이 단계, C3″메틸아미노화 그리고 C4″메틸화 단계에 관련한 생합성 과정을 규명하였고, 젠타마이신 B의 생합성 규명을 통해 얻은 신규 중간체들은 유전질환의 치료제로 활용될 수 있는 가능성 및 향후 신규 아미노글라이코사이드 계열 항생제의 개발 가능성을 보여주었다. 이는 향후 제약 산업의 고부가 가치 창출뿐만 아니라 국민 보건과 관련된 미래 사회 창출에 필수적인 원천 기술로서 매우 중요한 의미가 있다.