The Production of Sphingosine and Sphingosine -related Ceramide in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Engineering Using CRISPR-Cas9

Abstract

세라마이드 (ceramide)는 세포막 성분 중 하나로 외부로부터 피부를 보호하는 기능을 하고, 과도한 수분의 증발을 막아 보습효과 및 피부 재생 효과가 있어, 화장품 및 제약 산업에서 첨가제로 널리 사용되었다. 세라마이드 생산 방법은 기본적으로 천연물에서 추출한다. 기존의 세라마이드 이용은 동물 및 식물을 원료로 한정적으로 얻어졌다. 하지만, 동물성 세라마이드는 안정성의 문제로, 식물성 세라마이드는 적은 양과 추출 및 정제 방법의 어려움 및 인간의 세라마이드 구조와 다른 이유로 외면 받기 시작했고 다른 host를 이용한 세라마이드 개발이 요구된다. 그 대안으로 효모 (yeast)는 다른 미생물보다 인간 친화적으로 독성이 없어 GRAS (generally recognized as safe)에 속하며, 빠른 생장을 하며, 외래성 유전자를 잘 발현하고, 유전학적 도구와 정보가 풍부하므로 균주 개량이 용이하다는 장점을 갖기 때문에, 세라마이드 생산에 적합한 것으로 판단된다[16]. 하지만 현재까지, 효모에서의 세라마이드 관련 연구는 Candida utilis와 Saccharomyces cerevisiae로 한정적으로 진행되어, 관련 산업 균주 개발은 더디게 이루어지고 있다. 또한, 자연 상태의 효모에서의 세라마이드를 직접 분리하면, 수율 및 생산성 등 효율성이 매우 낮아, 실제 상용화가 불가능하다. 때문에 대사공학을 통한 미생물의 성능 개량 작업을 이용하여 그 효율을 높이는 것이 필수적이다. 따라서 본 연구는 S. cerevisiae를 이용해 최근 각광받고 있는 유전자 조작 기술인 CRISPR-Cas9 기술을 접목시켜, 세라마이드 생산량 조절을 위한 sphingosine 생산능을 가진 개량 균주의 개발 및 생산성 및 수율 증진을 목표로 연구를 진행하였다. 본 연구는 세라마이드 생산성을 조절하기 위해 다양한 sphingoid base의 확보에 초점을 두고, 세라마이드 합성에 관여하는 유전자를 조작하여 수율 증진을 꾀했다. 결과적으로, S. cerevisiae의 sphingolipid 대사과정의 관련 효소를 관여하는 주요 유전자를 발현 억제 및 과발현 시킴으로써, 본래 가지고 있지 않은 sphingoid base의 형태인 sphingosine을 생산하는 균주를 개발하였으며, ceramide 생산성도 증가했음을 확인했다. HPLC 분석 결과 sphingosine을 생산하기위해 DES1을 과발현 시켰을 때 kmDES1보다 HuDES1이 6배 가량 더 많은 생산량을 보였으나, 그 양은 16 ppm으로 수율이 높지 않다. 하지만 이는 기존에 S. cerevisiae를 통해 얻지 못했던, sphingosine을 생산하게 하면서 sphingosine-related ceramide의 생산을 확인했다는 점에서 다양한 세라마이드 확보 가능성을 확인했다고 볼 수 있다. 추가적으로 Pichia에서 아세틸레이션을 통해 sphingolipid를 배출하는 유전자로 알려진 RSB1을 과발현시켜 PHS 및 sphingosine 스트레스 하에서 세포의 생존력을 비교하였다. 그 결과, RSB1을 과발현시킨 실험군과 대조군 사이에서 표현형의 차이를 보이며, PHS와 sphingosine에 대한 내성이 향상된 것 확인하였다. 이는 RBS1 유전자를 통해, sphingolipid가 배출될 수 있음을 확인한 것으로 세라마이드를 세포 밖으로 추출할 수 있는 하나의 방법으로 이용될 수 있음을 시사한다. 추가 연구로 다른 유전자 조작을 통해, 보다 많은 sphingosine을 생산하는 균주 개발과 세라마이드 수율을 증가시키는 균주 개발이 필요하다. 또한 산업 균주로의 이용을 위해, 발효기를 이용한 대량 생산 기술 확보 및 추출 기술 개발이 요구된다.;Ceramide is one of the components of cell membranes. It has been widely used as an additive in the cosmetics and pharmaceutical industry due to its ability to protect the skin from the outside, prevent excessive moisture evaporation, and moisturize skin and regenerating effect. Ceramide production methods are basically extracted from natural products. Conventional use of ceramides was limited to animals and plants as raw materials. However, animal ceramides are a problem of stability, plant ceramides have begun to be neglected due to the small amount, difficulty of extraction and purification methods, and difference of human ceramide structure. Therefore, development of ceramides using other hosts is required. As an alternative, yeast is considered suitable for ceramide production. Because yeast is much more human-friendly than other microorganisms and belongs to GRAS (generally recognized as safe). Also, it grows fast, exudes exogenous genes well and has well-known genetic tools and information. However, studies on ceramide in yeast have been limited to Candida utilis and Saccharomyces cerevisiae, and ceramide related industrial strains has been developed slowly. Further, when the ceramide is directly separated from the yeast in a natural state, efficiency such as yield and productivity is very low, so commercialization is impossible. Therefore, it is essential to improve the efficiency by using microbial improvement work through metabolic engineering. Therefore, the present study was conducted to develop strains that have sphingosine-producing ability, and improved productivity and yield of the ceramide production control by combining CRISPR-Cas9 technology, which is a recent genetic engineering technique using S. cerevisiae. This study focused on securing various sphingoid bases to control the ceramide productivity and tried to increase the yield by manipulating genes involved in ceramide synthesis. As a result, we have developed a strain producing sphingosine, which is a sphingoid base form which is not originally possessed, by deleting and overexpressing a major gene known to the enzymes involved in the sphingolipid metabolism of S. cerevisiae. According to HPLC analysis results, when DES1 was overexpressed to produce sphingosine, HuDES1 produced 6 times more than kmDES1, but the yield was not high, only 16 ppm. However, it has been confirmed that sphingosine-related ceramide by producing sphingosine, which has not been obtained through S. cerevisiae and it suggested various ceramide can be obtained. In addition, the viability of cells under PHS and sphingosine stress was compared by overexpressing RSB1, a gene that excretes sphingolipid through acetylation in Pichia. As a result, the phenotype was different between the overexpressed group and the control group, and the resistance to PHS and sphingosine was improved. This confirms that sphingolipid can be released through the RBS1 gene, suggesting that ceramide can be used as a method to extract sphingolipid out of the cell. Further studies will require the development of strains that produce more sphingosine and the development of strains that increase ceramide yield through different genetic manipulations. In addition, for use as an industrial strain, it is required to get technology for mass production using a fermenter and to develop extraction technology.