Playable toy rescues stress-induced depressive behaviors by revitalizing dopamine function

Abstract

A playable toy is believed to produce positive effects on acquisition of cognitive skill, balancing and expressing emotion, and managing stressful events or thoughts. However, the detailed mechanism how a playable toy modulates cognition and emotion are almost unknown. The present study aims to investigate that the neurobiological mechanism underlying beneficial effects of a playable toy on emotional behaviors using a newly established animal model. To establish an animal model that is useful for study of playable toy effects on behaviors, different kinds of objects were tested whether they were suitable as a playable toy for mice. From those screen, a cotton gauze (20 x 40 cm) that was folded into a rod shape (3.5 x 1.5 cm) was finally chosen as a standard playable toy since it satisfied the basic criteria of a toy applicable for mice in that a presented object was explored, liked and played with for a certain period of time by subject mice in a home cage, but it did not induce habituation after repeated presentation. When presented with a cotton-gauze rod, mice increasingly explored it with the nose, mouth, and their front limbs over time. Mice exposed to a cotton-gauze rod showed significantly enhanced c-Fos expression, a marker of stimulation-induced neuronal activation, in many brain regions, including the medial prefrontal cortex (mPFC) and nucleus accumbens (NAc). HPLC-EC analysis indicated that a toy treatment increased the phasic dopamine release into the NAc. Next, it was examined whether a playable toy can change emotional behaviors. To address this, this study used a well-established stress-induced depression model and standard behavior test methods. Mice treated with restraint for 2 hours daily for consecutive 14 days (CRST) showed depressive behaviors in the tail suspension test (TST) and forced swim test (FST). Post-stress treatment of CRST mice with a playable toy for 1 hour daily for two weeks was found to rescue CRST-induced depressive behaviors as effectively as imipramine. Mice exposed to a single 2-h restraint showed an increase in the phasic dopamine release in the NAc, whereas CRST-treated mice exhibited no dopamine surge in response to the last 2-h restraint, suggesting an altered coping in the mesolimbic dopamine system. In contrast, post-stress treatment with a playable toy for 1 hour daily for 14 days in CRST mice normalized the allostatic change in the dopamine pathway with a recovery of the phasic dopamine release in the NAc, which was thus coincided with the rescue of depressive behaviors by a playable toy. Administration of the dopamine type 1 receptor agonist SKF 38393 in wildtype mice increased immobility time in the TST and FST. In contrast, CRST treatment in mice lacking type 1 dopamine receptor did not increase immobility time in the TST and FST, thus displaying resiliency to CRST. Consistent with these results, the designer receptors exclusively activated by designer drug (DREADD)-mediated silencing of the ventral tegmental area (VTA)-to-NAc circuit activity before each daily stress session blocked the depressive behaviors in CRST mice. CRST treatment led to significant gene expression alterations in the NAc as assessed by a microarray analysis, whereas repeated treatment with imipramine or a playable toy antagonized the stress-induced gene expression changes in the NAc to the levels of control mice. Among the list of the genes that altered in a stress- and toy-dependene manner, pituitary adenylate cyclase-activating peptide (Pacap), a neuropeptide gene, was selected for further analysis since Pacap mRNA expression was increased by CRST treatment and decreased to a control level by repeated imipramine or toy treatment during the post-stress period. Both heterozygous and homozygous Pacap KO mice showed resiliency to CRST treatment in the TST and FST. Moreover, SKF 38393-induced activation of D1 dopamine receptor failed to induce depressive behaviors in heterozygous Pacap KO mice. The ventral pallidum (VP) is one of the targets projected by NAc neurons. Inhibition of the PACAP receptor PAC1R in the VP by a RNAi method blocked the depressive behaviors of CRST mice in the TST and FST. DREADD-mediated silencing of the NAc-to-VP circuit during each stress session blocked depressive behaviors in the sociability test, TST, and FST. Next, it was investigated whether reactivation of the dopamine system is required for therapeutic effects of a playable toy. DREADD-mediated silencing of the VTA-to-NAc circuit during each playable toy treatment blocked the therapeutic effects of a playable toy in CRST mice. In summary, the results of the present study suggest that chronic stress induced depressive behaviors through stress-triggered repeated excessive dopamine release in the NAc and subsequent decreased neuronal activity of the VTA-to-NAc pathway, along with increased expression of PACAP in NAc neurons. In contrast, treatment with a playable toy in CRST mice antagonized the defective dopamine system and altered PACAP expression in NAc neurons and depressive behaviors. Overall, the present study presents a new animal model for study of playable toy effects on emotion behaviors, and identifies the dopamine system as a neurobiological mechanism underlying playable toy effects on emotional behaviors. ;장난감 놀이는 인지적 능력 습득과 감정의 표현 및 조절, 그리고 스트레스적인 상황 또는 생각을 관리하는데 긍적적인 영향을 부여한다. 하지만 이러한 장난감 놀이가 어떻게 인지적 그리고 감정적 측며에서 긍정적인 영향을 주는지에 대한 자세한 분자생물학적 기전은 아직 밝혀지지 않았다. 본 연구는 장난감 놀이 연구를 위한 새로운 동물모델을 제시하고, 장난감 놀이가 감정적 행동에 끼치는 분자생물학적 기전 연구를 진행하는 것을 목표로 삼았다. 장난감 놀이의 기전을 연구하기 위한 동물모델을 수립하기 위해서, 각기 다른 종류의 물체들을 이용하여 마우스에게 장난감으로 적합한지 테스트하였다. 이런 과정을 거쳐, 면거즈 (20 x 40 cm)를 원통 형태 (3.5 x 1.5 cm)로 접어 만든 장난감을 최종적으로 선택하였다. 마우스는 이 면거즈 장난감을 탐색하였고, 홈케이지 안에서 일정시간 이상 동안 가지고 노는 행동을 보였으며, 반복적으로 장난감을 제공했을 때 적응하는 반응을 보이지 않았으며, 이와 같은 이유로 원통형 면거즈를 새로운 마우스 모델에게 제시하기 적합한 장난감에 선정하였다. 면거즈 장난감을 제공하면, 마우스는 코와 주둥이, 앞발을 이용하여 면거즈 장난감을 탐색하고, 가지고 놀며 풀어 헤치는 등의 행동을 보였다. 장난감을 가지고 논 마우스는 내측전두엽 (medial prefrontal cortex, mPFC)와 중격핵 (nucleus accumbens, NAc) 지역과 함께 여러 변연계 뇌지역에서 c-Fos 단백질의 발현이 증가하며, 각 지역의 신경세포 활성이 증가함을 보였다. 또한 HPLC-EC 분석을 통해 NAc 지역으로의 도파민 방출이 증가함을 확인하였다. 다음으로, 장난감 놀이가 감정적 행동에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 하루 2시간 씩 14일 동안 감금 스트레스 (chronic restraint stress, CRST)를 처치하는 우울증 마우스모델을 이용하였다. CRST 처치 이후 하루 1시간 씩 14일 동안 장난감 놀이를 처치 받은 마우스는 꼬리매달기 검사 (tail suspension test, TST)와 강제수영 검사 (forced swimming test, FST)에서 마치 이미프라민을 처치받은 것과 유사한 수준으로 우울행동이 감소하였다. 마우스에게 한 번의 2시간의 감금 스트레스를 처치하면 NAc로의 도파민 방출이 증가하나, 14일 동안 스트레스가 반복되면 더 이상 스트레스로 인한 NAc 내 도파민 방출이 유도되지 않았다. 그리고, 14일 동안 장난감 놀이를 처치받은 마우스는 저하되었던 NAc 내 도파민 방출이 다시 되살아났다. CRST 초기의 스트레스에 의한 도파민 방출로 인해 반복 스트레스에 의한 우울행동 유도와 도파민 방출 저하가 유도되는지 확인하였다. 우선 도파민 1형 수용체의 작용제인 SKF 38393을 정상 마우스에게 반복 처치하였고, 이로 인해 TST와 FST에서 마우스에게 우울행동이 유도되었다. 반대로, 도파민 1형 수용체넉아웃 마우스는 CRST 처치를 받았음에도 TST와 FST에서 정상 수준의 우울행동을 보이며 스트레스 저항성을 보였다. 또한, DREADD 기법을 이용하여 복측 피개부 (ventral tegmental area, VTA)에서 NAc로 뻗는 신경경로의 활성을 감금 스트레스를 받는 동안 저하시켰을 때, 우울행동이 유도되지 않았다. 마이크로어레이 분석법을 통하여, CRST 처치로 인해 NAc 지역 내 많은 유전자들의 발현이 변화한 것을 확인하였으며, 반복적인 이미프라민 처치 또는 장난감 놀이 처치로 인해 이러한 스트레스에 의한 유전자 발현 변화가 대조군 수준으로 회복함을 확인하였다. 이러한 스트레스와 장난감 놀이에 의해 발현이 변화하는 유전자들 중, 뉴로펩티드 유전자인 Pacap를 스트레스와 장난감 놀이의 분자생물학적 기전의 표적 유전자 후보로 선정하였다. Real-time PCR 실험에서, NAc 지역 내 Pacap의 유전자 발현은 CRST에 의해 증가하였으며, 이미프라민과 장난감 처치로 인해 그 발현이 대조군 수준으로 감소하였다. Pacap 넉아웃 마우스는 CRST 처치 후 대조군 수준의 우울행동을 나타내며 스트레스 저항성을 보였고, 반복적인 SKF 38393 처치로 인한 우울행동도 나타나지 않았다. 이와 같은 Pacap 의존적인 우울행동은 NAc의 GABA 신경회로의 주요 표적지 중 하나인 복측 창백 (ventral pallidum, VP)의 PAC1R (Pacap 수용체)의 작용과 연관되어 있었다. RNAi 기법을 이용하여 VP의 PAC1R 작용을 저하시켰을 때 CRST로 인한 우울행동이 TST와 FST에서 발현되지 않았다. 또한, DREADD 기법을 이용하여 감금 스트레스를 받는 동안 NAc에서 VP으로 뻗어나가는 회로의 신경세포 활성을 억제하였을 때, TST와 FST에서 반복 스트레스로 인한 우울행동이 유도되지 않았다. 앞선 도파민과 Pacap를 경유하는 우울행동의 신경생물학적 기전을 근거로, 장난감 놀이로 인한 우울행동의 치유효과의 인과관계를 입증하는 실험을 진행하였다. DREADD 기법을 이용하여 장난감 놀이를 처치받는 동안 VTA에서 NAc로 뻗어나가는 회로의 신경세포 활성을 억제한 마우스는, 동일한 장난감 놀이를 경험했음에도 우울행동이 감소하지 않았다. 본 연구의 결과들을 종합하면, 장기간 스트레스로 인해 우울행동이 유도되며, 이는 NAc로 뻗어들어오는 도파민 신호에 의해 조절된다. 또한, 장난감 놀이는 장기간 스트레스로 인해 유도된 우울행동을 대조군 수준으로 감소시키며, 장기간 스트레스로 인해 감소한 스트레스에 대한 VTA에서 NAc로의 신경회로의 활성반응을 대조군 수준으로 회복시켜준다. 이러한 우울행동 유도 및 유지 및 장난감 놀이에 의한 우울행동 감소효과의 신경생물학적 기전에는 NAc에서 VP로의 신경회로에서 뉴로펩티드 PACAP가 중요한 매개체로 작용한다.