Study on the Interaction between Tumor Microenvironment and Glioblastoma during Malignant Progression via Insulin-like Growth Factor-Binding Protein 5 (IGFBP5) and NADPH oxidase 2 (NOX2)

Abstract

Glioblastoma (GBM) is the most aggressive and incurable primary brain tumor with a WHO grade IV glioma, which rarely responses to the current standard therapeutics: surgery followed by radiation and chemotherapy. The genetically unstable heterogeneous populations of cancer cells and the complex microenvironment cause high drug resistance and recurrence of GBM. In this study, I have successfully identified the key molecules that can effectively suppress the invasive characteristics of cancer cells and modulate the polarization of M2 macrophages in GBM microenvironment. In Part I, I reported Insulin-like Growth Factor-Binding Protein 5 (IGFBP5) as a promising target for GSC invasion through activing ROR1/HER2-CREB signaling axis. Using a GSC-derived brain tumor model, GSCs were characterized into invasive or non-invasive subtypes, and RNA sequencing analysis revealed that IGFBP5 was differentially expressed between these two subtypes. GSC invasion capacity was inhibited by IGFBP5 knockdown and enhanced by IGFBP5 overexpression both in vitro and in vivo, particularly in a patient-derived xenograft model. I demonstrate that IGFBP5 regulates GSC invasion, which triggers the formation of ROR1/HER2 (Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1/Human Epidermal growth factor Receptor 2) heterodimer to enhance CREB (cAMP Response Element Binding protein) oncogenic signaling. Importantly, using a tumor-specific targeting and penetrating nanocapsule-mediated delivery of CRISPR/Cas9-based IGFBP5 gene editing significantly suppressed GSC invasion and downstream gene expression, and prolonged the survival of orthotopic tumor-bearing mice. Collectively, my data reveal that IGFBP5-ROR1/HER2-CREB signaling axis as a potential GBM therapeutic target. In Part II, I found the significant correlation between NADPH Oxidase 2 (NOX2) expression and the patient survival in GBM. Furthermore, I discovered that NOX2 promotes M2 macrophages polarization in GBM microenvironment. By utilizing the NOX2 deficiency bone marrow derived macrophages (BMDM) within a co-culture system, I observed the reduction in the expression or activation of master regulators, namely STAT3, CEBPβ and NF-KB, associated with Mesenchymal (MES) subtype of GBM via AXL/PI3K/AKT signaling pathway. Alternatively, the deletion of NOX2 resulted in decreasing the population of M2 macrophages and attenuating intracranial tumor growth in orthotopic GBM xenografts. Interestingly, the analysis of global proteomics revealed that the activation of NK cells increased in NOX2 KO GBM model, accompanied by the upregulation of M1 macrophage population. Moreover, I demonstrated that combining a small-molecule pan-NOX inhibitor with TMZ or CCNU adjuvant therapy improved the chemotherapeutic responses in U87 GBM mice model. Therefore, these findings indicate that NOX2-derived ROS shed light on the critical role in both MES GBM progression and the modulation of tumor microenvironment. This part provides critical evidence supporting the potential therapeutic targeting of NOX2-expressing TAM as a viable strategy for malignant GBM patients. In summary, this study suggests that targeting the master regulator of invasive GBM stem-like cells as a promising therapeutic approach for infiltrative GBM. Additionally, modulating the M2 macrophage population by reducing ROS generation demonstrates the improved therapeutic responses in combination therapy. These findings provide critical pre-clinical evidence for the development of therapeutic approaches with the goal of improving the prognosis of patients through preventing GBM recurrence and overcome therapeutic resistance. ;교모세포종양(GBM)는 WHO 4급로서 가장 악성이며 치료 불가능한 원발성 뇌종양으로 환자의 생존율이 매우 낮다. 그리고 현재의 표준 치료인 수술, 방사선 및 화학요법에 반응 좋지 않고 매우 제한적이다. 또한, 유전적으로 불안정하며 다양한 종류의 암세포와 복잡한 미세환경으로 인해 GBM은 높은 약물 저항성과 재발을 유발한다. 따라서, 본 연구에서는 GBM 미세환경에서 암세포의 침습 특성을 효과적으로 억제하고 M2 대식세포의 극성을 조절할 수 있는 주요 분자를 성공적으로 식별하기 위하여 진행하였다. 제1부에서는 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질 5 (IGFBP5)을 ROR1/HER2-CREB신호를 통해서 GSC (GBM 줄기세포, GBM stem-like cell) 침습을 활성화시키는 유망한 표적으로 보고하였다. GSC 유래 뇌종양 모델을 사용하여 GSC를 침습성 및 비침습성 유형으로 분류하였으며, RNA 시퀀싱 분석을 통해 IGFBP5가 침습성 모델의 종양에서 특이적으로 발현하는 것을 발견하였다. 또한 IGFBP5의 높은 발현이 GSC의 침습능력을 기능적으로 촉진하고, GBM 환자의 예후를 좋지 못하게 한다는 것을 증명하였다. 특히 렌티바이러스를 이용해 IGFBP5를 과발현 또는 억제시킨 GSC를 삽입한 환자 유래 이종이식 (Patient-derived xenograft/PDX) 마우스 모델에서 IGFBP5는 GSC의 침습 능력이나 마우스의 생존에 유의한 조절 능력을 보여줌을 증명하였다. IGFBP5는 ROR1의 인산화를 유발하여 ROR1/HER2 이종 이형체 형성을 촉진하고, 이에 따라 CREB 전사조절인자를 매개하여 ETV5 와 FBXW9 발현을 유도하고, 이를 통해 GSC 침습 및 종양 형성을 조절하는 것을 밝혀냈다. 또한, CRISPR/Cas9 기반의 관통 나노캡슐을 이용해 IGFBP5 유전자를 편집하는 방법은 GSC 침습과 그 조절인자들을 효과적으로 억제하는 효과를 보였다. 종합적으로, 이런 IGFBP5-ROR1/HER2-CREB 신호경로가 잠재적인 GBM 치료 표적임을 보여준다. 제2부에서는 GBM에서 NOX2 발현과 환자 생존과의 유의한 상관관계가 있을 뿐만 아니라 NOX2가 GBM 미세환경에서 M2 대식세포의 극성화를 촉진한다는 것을 발견하였다. NOX2를 억제한 BMDM(골수유래 대식세포, bone marrow derived macrophage)을 이용한 공동 배양 시스템에 통해서 AXL/PI3K/AKT 신호전달 경로를 통해 GBM의 Mesenchymal 서브유형과 관련된 주요 조절자인 STAT3, CEBPβ 및 NF-KB의 발현 또는 활성화 감소를 관찰하였다. 반면, NOX2의 결손은 M2 대식세포의 수 감소와 뇌내 종양의 성장 감소를 초래하는 것은 보여준다. 흥미롭게도, 인산화 단백질체 분석 결과, NK 세포의 활성화가 NOX2 KO GBM 모델에서 증가하며, M1 유사 대식세포 표지자의 상승과 함께 관찰되었다. 또한, U87 GBM 마우스 모델에서 소분자 NOX 억제제를 TMZ와 병용으로 투여했을 때, CCNU또는 TMZ를 병용으로 투여했을 때보다, 생존율을 증가시킬 수 있음을 증명했다. 이로써, 내 연구 결과는 NOX2 유래 ROS가 Mesenchymal GBM 진행 및 종양 미세환경의 변조에 중요한 역할을 하는 것을 보여준다. 이는 NOX2 발현 TAM을 잠재적 치료 대상으로 하는 것이 악성 GBM 환자를 위한 유망한 치료 전략임을 나타내는 중요한 근거를 보여준다. 요약하자면, 본 연구는 침습적인 GBM 줄기세포의 주요 조절자를 표적으로 하는 것이 분산성 GBM에 대한 유망한 치료 접근법임을 시사한다. 또한 ROS 생성을 감소시켜 M2 대식세포 인구를 변조함으로써 치료 반응을 개선하는 결합 요법을 통해 미세환경을 개선한다. 이러한 결과는 GBM 재발을 예방하고 치료 저항성을 극복하기 위한 치료 접근법 개발을 위한 중요한 임상 전조 자료를 제공한다.