miRNA in Extracellular Vesicles for the Biomarker of Ischemic Stroke using Mice

Abstract

Ischemic stroke is a serious disease that cause permanent disabilities or death. Ischemic stroke causes immediate damage to brain cells. Early diagnosis and treatment are important for recovery and prognosis. However, current diagnosis methods are limited. EVs are nano size vesicle that can carry diverse materials from cell to cell. EVs have special ability to cross blood-brain barrier (BBB), which is why they are being studied in relation to brain diseases. Especially, recent studies suggested that miRNAs delivered by EVs are as novel biomarkers. Expression of some miRNAs is upregulated or downregulated according to disease progression. EVs protect miRNAs from degradation by RNases, ensuring that upregulated or downregulated miRNAs are intact. Surrounded by EVs, miRNAs that transfer from the parent cell to the recipient cell bind to complementary mRNA sequences in the recipient cell. Through this process, miRNAs can regulate target gene expression and affect on relief or degeneration of disease. To mimic ischemic stroke in mice, transient Middle Cerebral Artery Occlusion (tMCAO) surgery were used. To find differences between normal and stroke condition, Sham and tMCAO groups were compared. Mice were sacrificed in 24 hr after surgery for checking acute phase of ischemic stroke. EVs were obtained from mice plasma sample and purified EVs were confirmed by TEM, NTA, and western blot. Based on other studies of ischemic stroke, eight miRNA candidates were selected. The expression level of miRNAs was confirmed using RT-qPCR. These eight miRNAs showed meaningful differences between sham EV and tMCAO EV. Next, expression of eight miRNAs were confirmed in brain tissue because miRNAs secreted from brain cell and release to peripheral blood. However, the expression of miRNAs in brain tissue was not significantly different between sham and tMCAO ipsilateral and contralateral. Lastly, target genes of miRNA candidates were analyzed using KEGG (kyoto encyclopedia gene and genomes) and GO (gene ontology). These miRNAs were related with neurogenesis, blood-brain barrier, inflammation, and apoptosis, etc. In this study, eight miRNAs in mouse plasma EVs were confirmed as biomarker of ischemic stroke mouse. The target genes of miRNAs are usually involved in inflammation, neurogenesis, apoptosis, and proliferation, and their association with ischemic stroke progression was determined. ;허혈성 뇌졸중은 영구적인 장애나 사망을 초래할 수 있는 심각한 질병이다. 허혈성 뇌졸중은 뇌세포에 즉각적인 손상을 야기한다. 따라서 초기 진단과 치료가 회복과 예후에 중요하다. 그러나 현재 진단 방법에는 한계가 있다. EV는 세포와 세포 사이 다양한 물질을 전달할 수 있는 나노 사이즈의 소포체이다. EV는 혈관 뇌 장벽을 통과할 수 있는 특별한 능력을 가졌기 때문에 뇌 질환과 관련 지어 연구되고 있다. 특히, 최근 연구들은 EV가 전달하는 miRNA를 새로운 biomarker로서 제안하고 있다. 몇몇 miRNA의 발현은 질병의 진행에 따라 증가하거나 감소한다. EV는 miRNA를 RNase에 의한 degradation으로부터 보호하여 증감된 miRNA가 온전하도록 한다. EV에 둘러싸여 parent cell부터 recipient cell로 이동한 miRNA는 recipient cell에서 상보적인 mRNA 서열에 결합한다. 이 과정을 통해 miRNA는 타겟 유전자의 발현을 조절하고 질병의 완화 및 악화에 영향을 준다. 마우스에서 허혈성 뇌졸중을 모방하기 위하여, transient Middle Cerebral Artery Occlusion(tMCAO) 수술을 사용했다. 대조군과 실험군의 차이를 비교하기 위하여 Sham과 tMCAO 그룹을 비교하였다. 마우스는 허혈성 뇌졸중의 급성 단계를 확인하기 위하여 수술 후 24 시간 째에 희생시켰다. 마우스의 혈장 샘플에서 EV를 분리하고, 분리된 EV는 TEM, NTA, western blot으로 확인하였다. 허혈성 뇌졸중에 관한 다른 연구들을 기반으로, 여덟 개의 miRNA 후보를 선택하였다. miRNA의 발현 정도는 RT-qPCR로 확인하였다. 여덟 개의 miRNA는 Sham EV와 tMCAO EV 사이에서 의미 있는 차이를 보였다. 다음으로, 뇌조직에서 분비된 miRNA가 말초혈액으로 분비되기 때문에 여덟 개의 miRNA 발현을 뇌 조직에서 확인했다. 하지만 뇌조직에서 miRNA의 발현은 sham과 tMCAO ipsilateral, contralateral 사이에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 마지막으로, KEGG와 GO를 사용하여 여덟 개의 miRNA의 타겟 유전자들을 분석했다. 이들 miRNA는 inflammation, neurogenesis, apoptosis 등과 관련 있었다. 이 연구를 통해, 마우스 plasma EV에서 여덟 개의 miRNA를 허혈성 뇌졸중의 biomarker로 확인하였다. miRNA의 target gene들은 대개 inflammation, neurogenesis, apoptosis, proliferation 등에 관련이 있어 ischemic stroke 진행과의 연관성을 알아볼 수 있었다.