Screening of Anti-RUFY4(RUN and FYVE domain-containing protein 4) Antibodies by Phage Display Technology

Abstract

The regulation of osteoclast formation and function is important role in bone destruction and homeostasis. RANKL signaling is essential for the differentiation of osteoclast, and excessive secretion of RANKL can cause many bone-related diseases such as osteoporosis, rheumatoid arthritis, and bone metastasis of cancer. RUFY4 (RUN and FYVE domain-containing protein 4) is one of the genes induced by RANKL which controls autophagic flux by inducing tethering with autophagosome formation and lysosome. Autophagy dysregulation increases bone loss associated with alteration of osteoclast function and progression of osteoporosis. Therefore, in order to maintain the normal formation and activation of bone cells, autophagy needs to be properly regulated, and tools for the sensitive and specific detection and analysis of RUFY4 are essential for the investigation of autophagy. Here I discovered antibodies that specifically recognize RUFY4 from a human scFv phage library by phage display technology and ELISA screening. An anti-RUFY4 scFv that showed specific binding to murine RUFY4 in immunoblotting assay was expressed in mammalian cells (ExpiCHO-S) and purified. The process of converting two clones that showed specific binding to murine RUFY4 in immunoblotting assay into immunoglobulin G (IgG) format is ongoing. It is expected that the newly discovered anti-RUFY4 antibody could provide a viable tool for the reliable detection and quantification of RUFY.;파골세포는 뼈의 재구성 및 항상성에 중요하게 작용하는 세포이다. RANKL 신호전달은 파골세포의 분화에 필수적이며, RANKL의 과다분비는 골다공증, 류마티스 관절염, 암 뼈 전이 등 뼈와 관련된 많은 질병을 유발할 수 있다. RUFY4는 RANKL에 의해 유도되는 유전자 중 하나로, 자가소화포의 형성 및 리소좀과의 테더링을 유도함으로써 자가포식 변화를 유도한다. 자가포식의 조절 장애는 파골세포 기능의 변화 및 골다공증의 진행과 관련된 뼈 손실을 유발시킨다. 따라서 뼈 세포의 정상적인 형성과 활성화를 유지하기 위해서는 자가포식을 적절히 조절할 필요가 있다. 우리는 파지 디스플레이 (phage display) 기술과 ELISA 스크리닝을 통해 scFv 파지 라이브러리에서 RUFY4를 인식하는 항체를 발견하였다. 면역 블러팅 분석에서 murine RUFY에 특이적으로 결합하는 항 RUFY4 scFv를 포유류 세포인 ExpiCHO-S에 발현시켜 IgG 형태로 만들기 위한 실험을 진행중이며, 지금까지 RUFY4와 관련된 연구는 고품질 항체의 부족으로 인해 한계가 있었으나, 새로 발견된 항 RUFY4 항체는 RUFY4의 신뢰할 수 있는 검출 및 정량화를 위한 도구로 사용될 것으로 기대된다.