Development of LC-MS/MS-based CRB-5016 analytical method in rat plasma and its application to pharmacokinetic study

Abstract

The enzyme complex nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NOX) is a primary source of reactive oxygen species (ROS), such as the superoxide anion and hydrogen peroxide. Seven NOX isoforms share structural homology. NOX enzymes contribute to physiological mechanisms, such as immune defense, cell growth, angiogenesis, vascular pressure, cell suicide, and fertilization, by expression levels in various cell types and tissues. Therefore, NOX isoforms have been indicated as important therapeutic targets because NOX isoform dysregulation can cause various central nervous system degenerative diseases, cardiovascular diseases, and cancer. CRB-5016 is a new pan-NOX inhibitor candidate that targets acute respiratory distress syndrome, idiopathic pulmonary fibrosis, and nonalcoholic steatohepatitis induced by NOX-induced ROS generation. A quantitative analytical method is required to understand the pharmacokinetic profiles of CRB-5016. This study developed and validated a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analytical method to establish CRB-5016 concentration in rat plasma. Plasma samples were precipitated with acetonitrile (ACN) containing 0.1% formic acid (FA) and separated on the ZORBAX SB-C18 column (2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm, Agilent, USA). The mobile phase comprised water and ACN (20/80, v/v) containing 0.1% FA. The specificity of the method was confirmed by detecting the mass-to-charge ratio of CRB-5016 and internal standards. Linearity was established over the 5–1000 ng/mL range, and extraction recovery and stability were demonstrated according to Food and Drug Administration guidelines. Additionally, we conducted a pharmacokinetic study using intravenous and oral routes. Further, we analyzed CRB-5016 concentration in plasma samples using the validated LC-MS/MS method and evaluated its pharmacokinetic properties. The results revealed that CRB-5016 was slowly eliminated with a high elimination half-life and was well absorbed with more than 50% oral bioavailability in the rat body. Furthermore, the LC-MS/MS method proved to be reliable and suitable for CRB-5016 pharmacokinetic analysis in rats.;호흡곤란 증후군(ARDS), 특발성 폐섬유화증(IPF), 그리고 비알코올성 지방간염(NASH)은 사망률이 높거나, 암으로 발전 가능한 질환이지만, 현재 효과적인 치료방법이 없다. 또한 산화적 스트레스의 증가가 이들 질환의 발병 및 진행에 관여한다고 알려져 있다. 따라서, 산화적 스트레스 조절의 핵심 효소인 NADPH 산화효소(NOX)가 치료를 위한 표적으로 제안되어 왔다. CRB-5016은 여러 NADPH 산화효소 동위체(isoform)를 억제하는 pan-NOX 억제제이며, ARDS, IPF 그리고 NASH를 적응증으로 하여 개발된 신약후보물질이다. CRB-5016의 약동학적 특성을 확인하기 위하여 본 연구에서는 쥐 혈장에서의 CRB-5016의 농도를 평가하기 위한 분석법을 개발하고 검증하였으며, 약물동태학 실험을 진행하였다. 액체크로마토그래피 텐텀질량분석기(LC-MS/MS)를 이용하여 개발된 CRB-5016의 정량분석법을 미국식품의약국(FDA) 가이드라인 기준에 따라 검증하였다. 특이성은 텐덤질량분석기의 다중반응모니터링 스캔을 이용하여 CRB-5016과 CRB-5015(내부표준물질)의 특이적인 질량 대 전하의 비 (m/z)를 검출하여 입증하였다. 직선성은 5 - 1000 ng/mL의 농도 범위에서 확립되었으며, 일내 및 일간 정확성과 정밀성은 15 % 내외(최저정량한계는 20 % 내외)임을 확인하였다. 또한, 회수율과 안정성을 평가하여 본 분석법이 CRB-5016 정량분석에 적합함을 증명하였다. 약물동태학 실험은 정맥투여군의 투여량은 1 mg/kg, 경구투여군의 투여량은 5 mg/kg로 하여, 두 군에서 진행하였다. CRB-5016의 소실 반감기는 경구투여 시 평균 12.6시간으로 쥐 체내로부터 서서히 소실되었다. 또한, 절대 생체이용률은 51.2 %로 경구로 잘 흡수되는 양상을 보였다. 이상의 결과로 부터, LC-MS/MS 분석법이 신뢰할 수 있고, CRB-5016의 쥐에서의 약물동태 분석에 적합함을 확인하였다.