The Role of COVID-19 Infected Lung Epithelium Derived Exosome in Cardiovascular Disease

Abstract

Cardiovascular diseases are still one of the leading causes of death worldwide, and it is characterized by the development of atherosclerosis. Recently, several clinical studies suggested that coronavirus disease 2019 (COVID-19) may be in relation to the development of atherosclerosis. However, in addition to respiratory involvements, this infection can trigger cardiovascular manifestation, which is involved in “Long-COVID”. As most cardiovascular diseases are caused by atherosclerosis, which is initiated by endothelial dysfunction, I sought to elucidate the association between long-COVID and cardiovascular disease by focusing on microRNAs in exosomes. I used the lung epithelial cell line, Calu-3, to mimic the COVID-19 infection using the recombinant SARS-CoV-2 RBD protein. I purified and characterized exosomes from the conditioned culture medium of Calu-3. There were no characteristic differences between control exosomes (X-Exo) and RBD protein-treated Calu-3 derived exosomes (RBD-Exo). Using hyperlipidemic-conditioned human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), we observed that incubation of HUVECs with RBD-Exo enhances monocyte recruitment and infiltration. To investigate the mechanism of RBD-Exo-induced proinflammatory effects, I compared the miRNA contents in RBD-Exo using small RNA sequencing. In total, 6 miRNAs were upregulated (miR-548b-5p, miR-18a-3p, miR-29b-3p, miR-6859-5p, miR-6716-3p, miR-2110), whereas 1 miRNA (miR-16-5p) was downregulated in RBD-Exo. Following small RNA sequencing profiling and RT-qPCR, miR-548b-5p in RBD-Exo was dramatically upregulated compared to X-Exo. To investigate whether miR-548b-5p mediates endothelial inflammation and dysfunction, the KEGG analysis and Gene Ontology (GO) analysis were conducted. Both analyses have revealed that only miR-548b-5p was associated with NF-kappa B signaling pathway, and it can bind to 3’ UTR of IκBα as a target gene. Mechanistically, exosomal miR-548b-5p resulted in the activation of the NF-κB/eNOS pathway through silencing gene transcription and translation of IκBα. Collectively, infection with COVID-19 alters lung epithelium-derived exosome content and aggravates endothelial dysfunction and inflammation by upregulating miR-548b-5p in exosomes. miR-548b-5p can activate NF-κB /eNOS pathway in recipient endothelial cells by targeting IκBα. This study provides a new understanding of how COVID-19 may affect the development of cardiovascular disease and suggests that exosome-based therapies, specifically using microRNAs as a new biomarker, can be proposed for a new approach to long-COVID syndrome.;심혈관 질환은 여전히 전 세계적으로 주요 사망 원인 중 하나이며, 죽상 동맥 경화증의 발병을 특징으로 합니다. 최근 여러 임상 연구에서 코로나바이러스 감염증 2019 (COVID-19)는 죽상동맥경화증 발병과 관련이 있을 수 있다는 보고가 있습니다. 그러나 호흡기 관련 증상 이외에도, 이 감염은 "Long COVID"와 관련된 심혈관 증상을 유발할 수 있습니다. 대부분의 심혈관 질환은 내피 기능 장애에 의해 시작되는 죽상 동맥 경화증으로 인해 발생합니다. 본 연구에서는 세포 간 신호전달에 주요한 역할을 수행하는 엑소좀 (Exosome)과 그 안에 존재하는 마이크로 RNA에 초점을 맞춰 코로나 바이러스 감염증 2019와 심혈관 질환 사이의 연관성을 밝히고자 했습니다. 본 연구에서는 폐 상피 세포주 (Calu-3)와 SARS-CoV-2 RBD 재조합 단백질을 사용하여 COVID-19 감염 상황을 모방했습니다. Calu-3의 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리 및 정제하고 이의 특성을 분석했습니다. 대조군 엑소좀(X-Exo)과 RBD 재조합 단백질을 처리한 Calu-3 유래 엑소좀(RBD-Exo) 간에는 특징적인 차이는 없었습니다. 고지혈증이 유도된 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)를 사용하였고, 그 HUVEC에 RBD-Exo를 처리하면 단핵구의 모집과 침윤이 증가되는 것을 관찰했습니다. RBD-Exo가 유도하는 염증 효과의 메커니즘을 조사하기 위해 small RNA 시퀀싱 데이터를 사용하여 RBD-Exo의 miRNA 구성을 비교했습니다. 그 결과, 총 6개의 miRNA (miR-548b-5p, miR-18a-3p, miR-29b-3p, miR-6859-5p, miR-6716-3p, miR-2110)가 상향 조절된 반면, 1개의 miRNA (miR-16-5p)는 하향 조절된 것으로 나타났습니다. 그 중에서 small RNA 시퀀싱 데이터와 RT-qPCR 결과에 따르면, RBD-Exo안에 miR-548b-5p는 X-Exo에 비해 매우 증거 되어있음을 확인하였습니다. miR-548b-5p가 내피 염증과 기능 장애를 매개하는지 여부를 조사하기 위해 KEGG 분석과 GO 분석을 수행했습니다. 두 분석 결과, miR-548b-5p만이 NF-kappa B 신호전달경로와 연관되어 있으며, 표적 유전자로 IκBα의 3' UTR에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌습니다. 기전적으로, RBD-Exo 안에 존재하는 miR-548b-5p는 IκBα의 유전자 전사 및 번역을 억제시킴으로써 NF-κB/eNOS 신호 경로의 활성화를 초래하는 것을 확인하였습니다. 종합적으로 COVID-19의 감염은 폐 상피 유래 엑소좀 구성성분을 변화시키고, 그로부터 나온 엑소좀에서는 miR-548b-5p가 증가되어 내피 기능 장애와 염증을 악화시킨다는 것을 증명하였습니다. 뿐만 아니라 miR-548b-5p는 IκBα를 표적 단백질로 하여 내피 세포에서 NF-κB/eNOS 경로를 활성화시킬 수 있다는 것을 밝혀내었습니다. 이 연구는 COVID-19가 심혈관 질환 발병에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 새로운 이해를 제공하고, 특히 마이크로RNA를 새로운 바이오 마커로 사용하는 엑소좀 기반 치료법이 long-COVID 대한 새로운 접근법으로 제안될 수 있음을 시사합니다.