Phylogeography, Chloroplast Genome and Hybridization of Selected Plants in the Family Orchidaceae

Abstract

The family Orchidaceae is one of the largest angiosperm families, containing an extensive diversity that has attracted plant researchers in various fields. A number of studies of orchids have been conducted to date, but more research is needed to understand the vast and elaborate evolutionary mechanisms occurring in Orchidaceae. This study deals with orchid species whose phylogeography, cp genomes and hybridization have never before been examined. Chapter 1 addresses the phylogeography of Neottia japonica as distributed in East Asia: Korea, Japan, Taiwan and China. To uncover the historical factors that determine the current genetic structure of N. japonica in these regions, a total of 145 samples from 16 populations were collected. Three noncoding chloroplast regions were selected (ycf3 intron2, ndhA-ndhH, ndhA intron) for amplifying and analyzing. As a result, a total of 29 haplotypes were identified from four countries and a high level of genetic diversity (Hd, π, HT) was observed. The haplotypes were not shared between countries, and AMOVA results showed genetic variation influenced by geographic delimitation. The result of molecular dating indicated that N. japonica has undergone speciation during the Miocene and that the Japanese populations diverged first, followed by the Taiwanese and Korean populations. The Korean populations were founded most recently and were expected to have experienced recent population expansion. However, N. japonica has existed in this region for a long time. Additionally, N. japonica was found to be incapable of migrating through seed dispersion, and the East-China-Sea (ECS) has served as a strong barrier for this species. Chapter 2 presents the chloroplast genome of Neottia kiusiana and compares it with other cp genomes in Neottia. Neottia kiusiana is achloropyllous, leafless and fully mycoheterotrophic plant distributed in Korea and Japan. The plant sample used in this study was collected from Jeju Island in Korea. The plastome of N. kiusiana was determined to be 86,952 in total length, with a high level of genome reduction observed in the LSC and SSC regions. The size of the cp genome was similar to N. acuminata and N. nidus-avis, the latter of which appears to be the smallest cp genome in Neottia. In N. kiusiana, not only photosynthesis-related genes but also housekeeping genes were significantly degraded. These patterns in the cp genome support the conclusion that N. kiusiana is in an advanced or late stage of mycoheterotrophy evolution. Chapter 3 elucidates the hybrid origin of Goodyera × maximo–velutina, which was newly reported from Jeju Island in Korea, based on morphology and molecular data. The new hybrid shows morphological characters intermediate between G. maximowicziana and G. velutina; thus these two taxa are determined to be the putative parents. Also, these species are sympatric. To investigate the hybrid origin of G.× maximo–velutina, the ITS of nuclear DNA and three noncoding regions (psbA-trnH, trnS-trnG, trnL intron) of chloroplast DNA were analyzed. The number of leaves and the bract color were intermediate between the two putative parents. On the other hand, leaf color and leaf veins were similar to G. maximowicziana, and the color and puberulent characteristics of the pedicel and ovary were similar to G. velutina. The DNA regions used in this study were suitable for demonstrating the hybrid origin of G.× maximo–velutina. The three polymorphic nucleotide sites (112, 512, 652) detected from nrDNA data support the conclusions about the two putative parents of G.× maximo–velutina. The cpDNA data showed G. maximowicziana is the maternal species of the new hybrid. This result also supports the correlation between cpDNA and leaf morphology in Goodyera. ;난과(Orchidaceae)는 현화식물 중 가장 많은 식물 종을 포함한 과 중 하나로 난과의 종들은 다양한 분야의 식물학자들에게 관심의 대상이 되어 왔다. 본 연구는 그동안 연구대상이 되지 않았던 난과 식물 3종(아기쌍잎난초 Neottia japonica, 한라새둥지란 Neottia kiusiana, 섬털사철란 Goodyera × maximo-velutina)을 대상으로 계통지리학, 엽록체 유전체 분석 그리고 잡종의 기원에 대한 연구를 수행하였다. 제 1장에서는 동아시아의 한국, 일본, 대만, 중국에 분포하는 아기쌍잎난초의 계통지리학적 연구를 수행하였다. 이 지역에 분포하는 아기쌍잎난초 사이의 유전적 구조를 이루는 요인을 분석하고 계통지리학적 역사를 추론하기 위해 총 16개의 집단에서 145개의 아기쌍잎난초 재료를 채집하였다. 유전적 다양성을 파악하기 위해 3개의 엽록체 DNA 구간을 선별하여(ycf3 intron2, ndhA-ndhH, ndhA intron) 염기서열을 분석하였다. 이를 이용해 유전적 다양성 지수(Hd, π, HT), 계통학적 관계, 분자분기시기 등의 결과를 산출하였다. 그 결과 현재의 아기쌍잎난초는 높은 유전적다양성 값을 나타냈으며 각 나라별로 고유한 반수체형(haplotype)을 가지며 지역간의 유전적 반입이 일어나지 않는 것으로 나타났다. 분자분산분석(AMOVA)에서는 아기쌍잎난초 집단의 높은 유전적 다양성이 지역적 분리에 의한 것으로 나타났다. 분기시기 분석 결과에 따르면, 아기쌍잎난초는 마이오센(Miocene) 시기에 분기된 종으로 추정되고, 일본에 분포하는 아기쌍잎난초 집단이 가장 먼저 분리되었고 그 뒤로 대만과 한국 집단이 분기된 것으로 보인다. 이 중 가장 최근에 발견된 한국의 제주도 집단은 최근에 파생된 집단으로 예상되었으나, 분포 역사가 오래되었다는 증거가 관찰되었다. 따라서 아기쌍잎난초는 제주도에 오랫동안 존재하였으나 단순히 사람들에게 발견되지 않았던 것으로 추측된다. 또한, 아기쌍잎난초는 씨앗분산을 통한 집단의 이주가 불가능한 것으로 나타났으며, 이들이 분포하는 지역 사이에 존재하는 동중국해(ECS, East-China-Sea)가 이 종의 강력한 지리적 장벽으로 작용했다는 사실을 밝혀냈다. 제 2장에서는 한라새둥지란의 엽록체 유전체를 분석하였고, 현재까지 분석된 새둥지란속 식물들과 엽록체 유전체 특성을 비교하였다. 한라새둥지란은 난과에 속하는 근균종속영양식물(fully mycoheterotroph)로 잎과 엽록소가 없다. 한국과 일본에 분포하고 있으며, 본 연구에서는 한국의 제주도 자생지에서 채집된 개체를 이용하였다. 분석결과 한라새둥지란의 엽록체 유전체는 총 길이는 86,952 bp로 결정되었고, LSC와 SSC 구간에서 큰 폭의 유전체 감소를 보였다. 한라새둥지란 유전체는 애기무엽란(N. acuminata)과 N. nidus-avis와 크기가 유사하며 이들은 새둥지란 속에서 가장 작은 유전체를 가지는 종들이다. 새둥지란의 엽록체 유전체 내에서는 광합성에 직접적으로 관련된 유전자 뿐만 아니라 세포유지유전자(housekeeping gene)에서도 큰 유실이 발생했다. 이러한 결과를 통해 한라새둥지란이 이미 오래된 단계의 근균기생식물이라고 판단할 수 있다. 그리고 근균기생식물의 유전체 크기는 진화 단계가 진행됨에 따라 점점 축소되는 방향성을 보인다는 기존 결과들을 지지한다. 제 3장에서는 섬털사철란의 형태적, 분자적 분석을 통해 잡종의 기원식물을 밝혀냈다. 섬털사철란은 형태적으로 섬사철란(Goodyera maximowicziana)과 털사철란(G. velutina)의 중간 형질을 보였기 때문에 이 두 종을 잠재적인 부모종으로 설정하였다. 또한 섬사철란과 털사철란, 섬털사철란은 같은 지역에 서식하고 있는 종(sympatric) 이다. 형태적 형질 관찰과 함께 핵 DNA의 ITS 구간과 엽록체 DNA의 세 구간(psbA-trnH, trnS-trnG, trnL intron) 염기서열 분석을 실시하였다. 형태적으로 섬털사철란의 잎의 수, 포의 색은 섬사철란과 털사철란의 중간적인 특징을 보였다. 반면, 잎의 색과 잎맥은 섬사철란의 것과 유사하고, 꽃대와 씨방의 색과 털은 털사철란의 것과 유사하다. 염기서열 비교분석 결과, 본 연구에서 사용된 핵과 엽록체 DNA 구간은 섬털사철란의 기원을 밝히는데 유용한 것으로 나타났다. 정렬된 핵 DNA 염기서열 3개의 좌위(112, 512, 652)에서 뉴클레오타이드 다형성이 나타났으며, 클로닝을 통해 확인한 결과 섬사철란과 털사철란이 부모종이라는 사실을 지지하였다. 엽록체 DNA 분석결과 섬털사철란의 모계는 섬사철란인 것으로 나타났으며 이것은 사철란속에서 식물의 잎의 형태가 엽록체 유전자와 관련이 있다는 것을 지지하는 결과이다.